肝素泊洛沙姆水凝膠結(jié)合aFGF-bFGF在創(chuàng)面修復(fù)效果上的比較研究.pdf

1、目的：創(chuàng)面修復(fù)在臨床上仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGFs）與含有肝素的聚合物水凝膠結(jié)合被認(rèn)為是一個(gè)提高傷口愈合效率的有效方法。然而，將不同的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子與含有肝素的聚合物水凝膠結(jié)合應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)，通常導(dǎo)致不同的傷口愈合效果，并且生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)傷口愈合的潛在機(jī)制仍然不是十分清楚。因此，我們制備了溫敏性肝素泊洛沙姆（HP）水凝膠與不同的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（aFGF和bFGF）結(jié)合，用于在體的創(chuàng)面愈合研究。本研究旨在對(duì)未

2、來開發(fā)基于肝素的聚合物結(jié)合生長(zhǎng)因子的創(chuàng)傷敷料應(yīng)用于皮膚損傷提供一定參考價(jià)值。
　　方法：使用自主合成的新型材料HP水凝膠，選取“夾心冷法”進(jìn)行制備，分別加入aFGF和bFGF得到HP-aFGF和HP-bFGF水凝膠，并對(duì)其溫敏性、流變學(xué)、微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)和釋放率進(jìn)行測(cè)定。
　　為了評(píng)價(jià)水凝膠用于創(chuàng)面修復(fù)的效果，本課題建立C57BL/6小鼠全層皮膚切除創(chuàng)傷模型。所有動(dòng)物通過腹膜內(nèi)注射4％水合氯醛（0.1mL/10g）麻醉，并切除背

3、部面積。使用6-0尼龍縫合線將0.5mm厚的環(huán)形膠圈（外徑16mm，內(nèi)徑8mm）固定在背中線的任一側(cè)上。使用6mm圓形皮膚活檢穿孔器制備兩個(gè)全厚度皮膚傷口。
　　選取42只健康的C57BL/6小鼠，隨機(jī)分成六組。每組分別是生理鹽水組、空白載體肝素泊洛沙姆組（HP）、游離的酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組（aFGF）、游離的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組（bFGF）、肝素泊洛沙姆結(jié)合酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組（ HP-aFGF）和肝素泊洛沙姆結(jié)合堿

4、性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組（HP-bFGF），單劑量（1.6μg生長(zhǎng)因子/創(chuàng)面）給藥。為了避免交叉污染，所有傷口接受相同的治療。藥物治療后的第0天、7天、10天、14天和17天測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率(%)=（造模第一天創(chuàng)面面積—取材日創(chuàng)面面積）/造模第一天創(chuàng)面面積×100%。在給藥后第7天和第17天處死小鼠，立即取其傷口周圍皮膚組織用于組織學(xué)評(píng)價(jià)。HE染色、馬森三色染色評(píng)價(jià)組織形態(tài)變化以及膠原的產(chǎn)生；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組

5、織中細(xì)胞角蛋白、PCNA、I型膠原蛋白和III型膠原蛋白的表達(dá)；免疫熒光觀察組織切片中血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子（CD31）的表達(dá)，評(píng)價(jià)血管再生情況。
　　結(jié)果：
　　1.體外實(shí)驗(yàn)表明，本實(shí)驗(yàn)制備的水凝膠具有良好的溫敏性，SEM鏡下觀察可見許多彼此相互連接的海綿狀結(jié)構(gòu)，有利于生長(zhǎng)因子通過這些多孔三維網(wǎng)絡(luò)立體結(jié)構(gòu)擴(kuò)散并實(shí)現(xiàn)其釋放。兩種水凝膠釋放系統(tǒng)均表現(xiàn)出aFGF和bFGF的持續(xù)釋放超過10天。當(dāng)與HP-bFGF水凝膠釋放的bFG

6、F（釋放量約24.3%）相比，HP-aFGF釋放更多的aFGF（釋放量接近42.8%），表明不同的生長(zhǎng)因子在與含有肝素的水凝膠進(jìn)行結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的差異，影響了之后生長(zhǎng)因子從水凝膠材料中的釋放行為。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，HP-aFGF水凝膠組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯示出最高的創(chuàng)面愈合率，并且在第17天創(chuàng)面愈合率達(dá)到96.1±6.4%，給予其他創(chuàng)傷敷料組的創(chuàng)面愈合率以降序排列為：HP-bFGF水凝膠組（91.3±10.9%），游離的bFGF組（7

7、2.9±11.8%），游離的aFGF組（68.8±9.3%），單純的HP敷料組（65.8±13.6%）和給予生理鹽水組（60.8±18.4%）。這些數(shù)據(jù)表明在傷口愈合過程的早期階段，HP和aFGF之間的協(xié)同相互作用在創(chuàng)口部位起到更有效的促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用。
　　3.蘇木精-伊紅染色和馬森三色染色表明HP-aFGF和HP-bFGF水凝膠改善肉芽組織的形成和促進(jìn)膠原沉積，其中HP-aFGF水凝膠顯示出比HP-bFGF水凝膠相對(duì)更高的促進(jìn)

8、肉芽組織生產(chǎn)和膠原沉積能力。
　　4.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明HP-aFGF和HP-bFGF水凝膠在創(chuàng)傷部位能夠持續(xù)釋放生長(zhǎng)因子，從而上調(diào)細(xì)胞角蛋白、PCNA、I型膠原蛋白和III型膠原蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的形成，有利于細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移，其中以HP-aFGF水凝膠效果最佳。
　　5.免疫熒光染色結(jié)果表明相比于其它實(shí)驗(yàn)組，HP-aFGF和HP-bFGF水凝膠都能促進(jìn)新生血管的生成，其中HP-aFGF水凝膠組有

9、更多的CD31表達(dá)。
　　結(jié)論：與對(duì)照組和單純HP水凝膠組相比，其它四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的創(chuàng)面愈合效果均有提高，但相比于單獨(dú)使用成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，HP-aFGF和HP-bFGF水凝膠在促進(jìn)傷口閉合，肉芽組織形成，再上皮化，促進(jìn)新生血管生成，上調(diào)PCNA和膠原蛋白的表達(dá)表現(xiàn)出卓越的治療效果。其中， HP-aFGF水凝膠敷料比HP-bFGF水凝膠敷料表現(xiàn)出更高的促愈合效果，表明不同的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子由于其表面電荷性質(zhì)的不同，影響其與HP水凝