酶聯(lián)免疫吸附實驗－乙肝兩對半測定

1、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) －乙肝兩對半測定,酶聯(lián)免疫吸附實驗原理,將抗原(或抗體)結(jié)合到固相載體上，當加入陽性標本后，相應抗體(或抗原)結(jié)合到固相抗原(或抗體)上，利用酶標記的抗抗體(或抗體)可檢測出標本中與固相抗原(或抗體)結(jié)合的抗體(或抗原)。間接法、夾心法、競爭法、捕獲法,乙型肝炎病毒,嗜肝病毒科－雙鏈DNA病毒三種病毒顆粒 小球型：由HBsAg組成，不含核酸管型：由小球型連接

2、而成大球型(Dane顆粒)：完整，有感染性,乙肝病毒血清標志物,HBsAg第一個出現(xiàn)，感染后1-2周即可陽性陽性表示存在HBV感染HBsAb出現(xiàn)在HBsAg消失后保護性抗體疫苗免疫成功的標志,乙肝病毒血清標志物,HBeAg病毒復制標志傳染性強HBeAb 傳染性降低長期存在是DNA與肝細胞整合的結(jié)果,乙肝病毒血清標志物,HBcAg HBV復制的標志血清中檢測不出來IgM-HBcAb 急性HBV感染IgG

3、-HBcAb急性感染恢復期和慢性持續(xù)感染,乙肝病毒血清標志物檢測原理,,試劑盒組成,包被板HBsAg－紅色HBsAb－綠色HBeAg－藍色HBeAb－粉紅色HBcAb－橘黃色,試劑盒組成,陰性對照和陽性對照酶標記物(HBeAb測定試劑中含中和抗原)底物A和底物B終止液洗滌濃縮液,操作步驟,平衡：將試劑盒各組分從盒中取出，平衡至室溫(18-25℃ )。配洗滌液：充分搖勻濃縮洗滌液(如有晶體應充分溶解)，用蒸餾水或去離

4、子水按1:19稀釋。編號：將微孔條固定于支架，按序編號。,操作步驟,加樣：分別用加樣器在孔中加入陰、陽性對照或待測血清樣本50ul (HBcAb測定時待測血清用生理鹽水1:30稀釋－50ul血清+1.5ml生理鹽水)。加酶：分別在每孔中加入酶標記抗體50ul (HBeAb測定時還要在每孔中加入中和抗原HBeAg50ul)，輕拍混勻。,操作步驟,溫育：置37℃溫育60分鐘，室溫平衡5分鐘。洗滌：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完后扣干(每

5、次洗滌保持30-60秒的浸泡時間)。顯色：每孔加底物A、B各50ul，輕拍混勻，置37℃避光15分鐘。終止：每孔加終止液50ul，混勻。觀察結(jié)果。,結(jié)果判斷,肉眼判定(見前表)酶標儀判定：用酶標儀單波長450nm或雙波長450nm/630nm測定各孔OD值，并根據(jù)cut-off值判定結(jié)果OD值>cut-off值為陽性OD值<cut-off值為陰性,注意事項,濃縮洗滌液配制前充分搖勻。加樣本時要加到孔底。加試劑

6、前應將試劑瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。如果滴加，滴加前應棄去1-2滴。,注意事項,滴加時瓶身應保持垂直，以使滴量準確。勿將試劑滴在孔壁上。洗滌時各孔須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶殘留。洗滌時注意孔與孔之間的交叉污染。脂血，溶血可影響結(jié)果。,注意事項,所有樣本都應按傳染源處理。樣品顯色深淺與樣品中抗體的含量沒有一定正相關。任何一種測試都不能絕對保證樣品中沒有低濃度的抗體存在。不同品名、不同批號的試劑不可混用，以免產(chǎn)生錯誤結(jié)果。,常見模