血細胞分析的溯源

1、血細胞分析的溯源及質(zhì)量保證,國際參考方法建立國際參考方法vs目前方法學(xué)的溯源血液學(xué)實驗室的質(zhì)量保證,血細胞分析的基本內(nèi)容,紅細胞計數(shù)白細胞計數(shù)血小板計數(shù)血紅蛋白濃度的測定白細胞分類,血球之父，行業(yè)鼻祖,1947年，華萊士.庫爾特先生獲得庫爾特原理的發(fā)明專利。迄今，全球有95%的血細胞分析儀采用庫爾特計數(shù)原理。1953年，全世界第一臺血細胞計數(shù)儀由庫爾特家族研制誕生。,溯 源,血細胞計數(shù) 顯微鏡計數(shù)→

2、庫爾特計數(shù)→多參數(shù)計數(shù)（物理、化學(xué)、免疫學(xué)法）相關(guān)問題：檢測結(jié)果大相徑庭(室間差異)，需標準化,歐洲血液學(xué)會召開了題為“血細胞分析技術(shù)及其標準化”的研討會——1963年，里斯本1、成立國際血液學(xué)標準化委員會( International Council for Standardization in Haematology)2、解決室間差異3、建立血液細胞分析的國際參考方法4、建立溯源體系：各方法與國際參考方法比較,溯 源

3、,參考方法（Reference method）,一種可清楚和準確描述的用于特定檢測的技術(shù)，該技術(shù)要有依據(jù)，可提供高度準確和精密的實驗數(shù)據(jù)以評價其他實驗方法檢測結(jié)果的有效性。若有決定性方法，參考方法的準確性必須與決定性方法進行比較。參考方法應(yīng)溯源至一級計量標準并且須標示不準確度和不精密度。 （ICSH）,紅細胞國際參考方法（ ICSH， 1994年）,原理：電阻法（ ZBI 法）方法：采用Coulter ZBI電子細胞計數(shù)儀（單通

4、道、半自動），測定固定容量的顆粒數(shù)。用等滲緩沖生理鹽水作1/50000倍稀釋，測量和糾正重合誤差。單通道計數(shù)儀，能用于檢測通過小孔的紅細胞、白細胞，小孔為100µm和70µm，其長度：直徑比率為1。用水平壓力計控制稀釋細胞懸液的流量為1ml，與脈沖分析儀連接，設(shè)置閾值下限，微型計算機采集數(shù)據(jù)糾正重合誤差。對于新鮮血和乳膠顆粒重復(fù)測定精度可達0.35%。,☆技術(shù)要求：1、檢測系統(tǒng)所有血液流路部分都采用多年不會變形的石

5、英玻璃部件；2、定量部使用水銀壓力計；3、稀釋使用A 級的精密燒瓶和精密吸管；4、為了最大程度減少流體檢測中的誤差, 設(shè)計盡可能簡單。,紅細胞國際參考方法（ ICSH， 1994年）,利用不同濃度的標本同時通過檢測部位的細胞數(shù)的比例不同的原理,以連續(xù)稀釋的檢測結(jié)果計算出無限稀釋倍率濃度時的檢測結(jié)果(在該濃度下,可認為沒有細胞同時通過檢測部) ,并將該結(jié)果確定為所測標本的“真值”。,紅細胞國際參考方法（ ICS

6、H， 1994年）,白細胞國際參考方法（ ICSH， 1994年）,ZBI 法： 只作一次稀釋，加入Zapoglobin后在1-5分鐘內(nèi)計數(shù)。其他同紅細胞計數(shù)要求,血小板的國際參考方法（ ICSH， 2001年）,原理：流式細胞儀間接計數(shù)血小板方法：采用EDTA抗凝全血，加特異性熒光標單抗（CD41和CD61）染色血小板，被染色血小板在流式細胞儀上根據(jù)熒光強度和散射光，得出PLT和RBC比率，再根據(jù)血小板和紅細胞的比率,乘以

7、紅細胞參考方法所檢測得到的紅細胞真值來間接計算出血小板的真值。計數(shù)至少50000個血小板，精度可達2%。用血細胞計數(shù)盤直接計數(shù)血小板的方法，因為計數(shù)盤誤差為1%，若計數(shù)500個血小板，精度為5%。,測定溶解紅細胞中血紅蛋白轉(zhuǎn)化成氰化高鐵血紅蛋白的吸光度,血紅蛋白國際參考方法（ ICSH，1978年）,技術(shù)要求：1、分光光度計的質(zhì)量,2、石英比色杯的精度,3、標本的稀釋精度,4、根據(jù)參考方法中的規(guī)定對試劑進行調(diào)整,5、按照規(guī)

8、定使用清潔的過濾網(wǎng)對標本進行 測試前的過濾等。,血紅蛋白國際參考方法（ ICSH，1978年）,PCV 國際參考方法（微量離心法）,該法同精密毛細管法相比,從開始操作開始到往精密毛細管內(nèi)吸入紅細胞的步驟是相同的,但是計算時卻慎重地避開了精密毛細管的上部和下部僅取中央部分,通過國際參考方法測定該部位的血紅蛋白濃度。其結(jié)果與國際參考方法測得的全血的血紅蛋白濃度的比率為PCV。,血細胞分析結(jié)果的溯源性,使用國際參考方法對加

9、入抗凝劑EDTA2K的正常人新鮮血液進行檢測,其結(jié)果作為該標本各指標的真值（A）。,使用要校準的血細胞分析儀(下稱檢測系統(tǒng)) ,對同一標本進行檢測,并對檢測結(jié)果進行修正使其與國際參考方法的檢測結(jié)果相同,該檢測系統(tǒng)(B) 與國際參考方法具有可溯源性,即A = B。問題：如果將某一區(qū)域內(nèi)所有相同的檢測系統(tǒng)(C) 都使用上述的同一份新鮮健康人血液進行檢測,并把檢測結(jié)果修正到與國際參考方法一致,實際操作中會存在許多困難。,血細胞分析結(jié)果的溯源

10、性,用已溯源到國際參考方法的檢測系統(tǒng)(B) 檢測可以長期保存的固定后的血液,然后再用其他相同的檢測系統(tǒng)(C) 檢測該樣品,并把所得結(jié)果修正到與(B) 相同,此時,市場上相同的檢測系統(tǒng)便可以同與國際參考方法可溯源的儀器進行間接溯源,即B = C。 ∵A = B ,B =C ∴A = C結(jié)論：市場上的檢測系統(tǒng)都可以與國際參考方法進行溯源,血細胞分析結(jié)果的溯源性,用C 對其他不同檢測系統(tǒng)D 進行溯源性校準時, 可以假

11、定C 為A ,如果兩者之間使用新鮮健康人血液具有互換性的話,再用固化后的血液進行調(diào)整使C = D , ∵ A =B ,B = C ,C = D ∴ A = D , 結(jié)論：不同檢測系統(tǒng)也與國際參考方法具有可溯源性。,血細胞分析結(jié)果的溯源性,繼續(xù)推進此溯源鏈，就可以推進各國、各地域的標準化,最終實現(xiàn)各單位間檢測結(jié)果的標準化。,血細胞分析結(jié)果的溯源性,溯源 儀器校正、檢定（宏觀）日常

12、工作質(zhì)量保證：室內(nèi)、室間質(zhì)控（微觀）,,1、質(zhì)量保證的過程2、室間質(zhì)量控制（PT方案）3、室內(nèi)質(zhì)量控制4、方法學(xué)評價/儀器比對,血液學(xué)實驗室的質(zhì)量保證,分析前：標本的采集 （病員信息、采集過程）分析中：目的，原理，標本要求，試劑，質(zhì)量控制，操作步驟，儀器保養(yǎng)、工作人員能力要求、結(jié)果解釋和誤差來源 分析后：影響測試結(jié)果的因素分析、取報告的時間(TAT）、投訴與反饋,質(zhì)量保證的過程,PT方案 (Proficiency tes

13、ting) 通過實驗室之間的比對判斷實驗室的檢測能力的活動。是室間質(zhì)量評價的重要方案，通過參加此項能力比對檢驗活動，可持續(xù)監(jiān)控實驗室分析性能，確保檢測結(jié)果的準確性、可重復(fù)性和可比性，促進實驗室質(zhì)量改進。,室間質(zhì)量控制（PT方案）,能力比對分析（proficiency testing，PT）是室間質(zhì)量評價技術(shù)方案之一。它最初起源于美國，后來許多國家包括我國也采用了此模式，PT已成為全球性室間質(zhì)量保證系統(tǒng)（Extenalnal qu

14、ality assurance system，EQAS）的主要內(nèi)容。其方法是將未知標本分發(fā)給各實驗室，對回報結(jié)果進行分析，判斷實驗室獲得正確測定結(jié)果的能力，通過各實驗室間持續(xù)的比較，為衡量實驗室的質(zhì)量提供可靠的標準。為了保護病人的利益和公眾的福利，美國國會通過了 1988年臨床實驗室修正案（clinical laberatory improvement amendrnent，CLIA’88），強制性地將PT作為實驗室認可的主要內(nèi)

15、容之一。,室間質(zhì)量控制（PT方案）,CLIA’88的PT方案規(guī)定，每年至少進行3次PT調(diào)查，每次調(diào)查至少包括5個不同的質(zhì)控標本，即在一年的時間內(nèi)，對于任一項目至少可得15個測定。對某個特定分析結(jié)果如落于規(guī)定限內(nèi)，則判為接受結(jié)果；否則為不可接受結(jié)果。對某一個接受結(jié)果，不再進行優(yōu)劣分級。,室間質(zhì)量控制（PT方案）,從PT報告中可以獲得兩個重要信息：①你自己的實驗室與使用同一方法的其它實驗室結(jié)果的差異；②與做同一試驗，但使用不同方法的實驗

16、室結(jié)果比較的情況。,意 義,①評價實驗室的分析能力；②監(jiān)控實驗室可能出現(xiàn)的技術(shù)問題；③改正存在的問題；④改進分析能力、試驗方法和同其它實驗室 的可比性；⑤教育和培訓(xùn)實驗室工作人員，以及評價工作人員的工作能力；③作為實驗室質(zhì)量保證的外部監(jiān)督工具（CLIA88要求）。,PT匯總報告的意義,①了解所有參加 PT的實驗室成績分布情況。定量 PT報告包括同組的均值、標準差、變異系數(shù)、結(jié)果分布和有關(guān)描述，以及結(jié)果的頻數(shù)分布。這些

17、數(shù)據(jù)可以比較同組之間 PT結(jié)果的差異和更多有用的信息。②監(jiān)測實驗室長期的工作狀態(tài)；指導(dǎo)實驗室工作人員的最低工作水平；提供實驗室準確度和精密度的客觀證據(jù)。,質(zhì)控表的解釋 －－Westgard 規(guī)則BULL’S測試規(guī)則（移動平均數(shù)法 ）用病人標本監(jiān)測質(zhì)量控制Delta檢查的使用,室內(nèi)質(zhì)量控制,多規(guī)則質(zhì)控技術(shù)（Westgard 規(guī)則）,實驗室工作人員有時對一些微小變化的質(zhì)控數(shù)據(jù)很難解釋，使用多規(guī)則質(zhì)控技術(shù)可揭示一些潛在的質(zhì)量問題。其中

18、有些規(guī)則對隨機誤差敏感，有些對系統(tǒng)誤差敏感。方法：即使用一組質(zhì)控規(guī)則來判定分析是否在控，Westgard使用五個不同的規(guī)則來判斷分析的可接受性，即在Levey－Jennings質(zhì)控圖規(guī)則的基礎(chǔ)上增加了R4s 、41s和10x規(guī)則，由此提高了系統(tǒng)誤差的檢出概率。質(zhì)控圖的制作方法同Levey－Jennings質(zhì)控圖的制作，即使用不同濃度的兩份質(zhì)控品，每日隨病人標本測定，將結(jié)果分別點在相應(yīng)的質(zhì)控圖上。,Westgard 規(guī)則,（1）12s：

19、一個質(zhì)控結(jié)果超過2s。提示警告。（2）13s；一個質(zhì)控結(jié)果超過3s。提示存在隨機誤差。（3）22s：兩個連續(xù)質(zhì)控結(jié)果超過2s 。提示存在系統(tǒng)誤差。（4）R4s：同批兩個質(zhì)控結(jié)果之差的值超過4s，即一個質(zhì)控結(jié)果超過-2s，另一質(zhì)控結(jié)果超過了+2s。提示存在隨機誤差。（5）41s：一個質(zhì)控品連續(xù)四次的結(jié)果都超過+1s或-1s，或兩個質(zhì)控品連續(xù)兩次的測定結(jié)果都超過+1s或-1s 。提示存在系統(tǒng)誤差。（6）10X：十個連續(xù)的質(zhì)控結(jié)果在

20、平均數(shù)的一側(cè)。提示存在系統(tǒng)誤差。,BULL’S測試規(guī)則（移動平均數(shù)法 ）,移動平均數(shù)法是基于病人群體中紅細胞指數(shù)（MCV，MCH、MCHC）是穩(wěn)定的這個前提，對紅細胞指數(shù)進行連續(xù)的統(tǒng)計學(xué)分析來監(jiān)測細胞計數(shù)儀操作性能的方法。。,建立移動平均數(shù)MCV，MCH，MCHC的可接受范圍：應(yīng)連續(xù)測定500個病人標本，計算每個指標的均數(shù)，可接受范圍確定為均數(shù)±3%。將這些范圍輸入細胞分析儀中，血細胞分析儀可將20個標本定為一組計算出動態(tài)均

21、數(shù)并且確定這些動態(tài)均數(shù)是否落在可接受范圍內(nèi)。當動態(tài)平均數(shù)超出可接受范圍時，儀器會提醒工作人員。如果一個動態(tài)平均數(shù)不可接受，應(yīng)該選出前20個標本，因為這種方法對病人群體是敏感的。如果這20個標本來自腎透析病人或者腫瘤病人，那么動態(tài)平均數(shù)的變化則是由于病人群體的問題而非儀器問題引起。一個真實的報警提示儀器存在著影響一個或多個紅細胞參數(shù)(RBC、H b、或Hct)的儀器問題。,BULL’S測試規(guī)則（動態(tài)平均數(shù)）,用病人標本監(jiān)測質(zhì)量控制,用

22、EDTA抗凝標本進行細胞計數(shù)的優(yōu)點之一就是可以用它來監(jiān)測超過24小時的儀器的重復(fù)性。從早上的測試標本中選出五個標本，測定每個標本的均值并且將每個標本分成兩份，即相同的兩批標本。第一批標本用來檢測24小時內(nèi)儀器的精密度，這批標本每四小時測一次，并計算出24小時內(nèi)的SD、CV。另外一批于冰箱保存24小時，用于監(jiān)測儀器的日間精密度，24小時后測定每一個樣本的均數(shù)。將初始均數(shù)和24小時測定均數(shù)進行比較來決定均數(shù)的可接受范圍。每個實驗室應(yīng)建立自己

23、的可接受限。,Delta檢查,Delta檢查依賴對一個特定病人的連續(xù)檢測，通過對一個病人的最新檢測結(jié)果與最近一次檢測結(jié)果進行比較，來檢測某一隨機誤差，這種檢測誤差的方法即是Delta檢查，它已是實驗室信息系統(tǒng)(LIS)所提供的最有價值的信息。,為確定在規(guī)定時間間隔內(nèi)某特定實驗（如Hb）的連續(xù)測定結(jié)果之間的可容許差別，應(yīng)建立一個容許限，這個容許限定義為LIS對異常結(jié)果進行標記提示時的限度。計算Delta檢查的差別既可以用絕對值來表示，也可

24、以用百分數(shù)來表示，無論用哪種方法，建立的Delta限應(yīng)當是Delta檢查失敗時真正的結(jié)果改變不被標記。如果仔細設(shè)置比較的時間范圍以及最大容許誤差，正確的結(jié)果就不會被標記。因此，一個Delta檢查最可能的原因是標本錯誤或者是隨機檢測錯誤。在血液學(xué)實驗室中某些項目具有非常小的個體內(nèi)變異尤其是紅細胞指數(shù)、血小板計數(shù)、凝血酶原時間和其他凝血研究等。當這些參數(shù)出現(xiàn)一個Delta檢查時，結(jié)果報告之前應(yīng)進行復(fù)查。,Delta檢查,方法學(xué)評價/儀器比對

25、,一種新方法或者新儀器的選擇，評價，改進都必須遵循已建定的方案，每個實驗室應(yīng)設(shè)計出自己的一套方法或儀器的選擇，評價，改進方案。,儀器選擇,成立專門的委員會來進行選擇：成員包括血液學(xué)管理者、臨床實驗室專業(yè)人員、實驗室信息系統(tǒng)人員、質(zhì)量主管、生物醫(yī)學(xué)工程師和實驗室的主管性能評價調(diào)查 ：已使用該儀器人員、商家、文獻考慮因素：測試項目的費用，試劑，試劑有效期和保存條件，質(zhì)量控制，試驗的敏感性，特異性和線性，所需的儀器和設(shè)備，分析時間和所需要

26、的標本類型。,分析的可靠性,在購買新的儀器或者引入新方法學(xué)的同時，實驗室必須通過一系列的試驗研究來證實該儀器和/或該方法的可操作性。評價：隨機誤差和系統(tǒng)誤差,隨機誤差,檢查批內(nèi)精密度，根據(jù)病人標本中被分析物的醫(yī)學(xué)決定水平選擇不同濃度的樣本，將同一病人標本分為10到20等份作為同一批進行檢測。計算其均數(shù)、標準差、變異系數(shù) 。CV值≦生產(chǎn)廠家的CV值，則批內(nèi)精密度為可接受；如果測定的CV值大于生產(chǎn)廠家的CV值，則查出該數(shù)據(jù)并將其看作離

27、群值剔除并且重新計算CV。如果該CV值仍然不可接受，那么這種方法存在的隨機誤差或試劑和/或操作的認為誤差都會影響精密度測定,系統(tǒng)誤差,系統(tǒng)誤差可通過新方法和一種已知是準確的方法對同一病人標本的測定結(jié)果來評價。將一份病人標本分為幾等份（NCCLS建議至少40個樣本，100個更好）進行檢測。樣本應(yīng)被隨機分配，以便能夠更具有臨床代表意義，理論上他們還應(yīng)該不同的病理條件。選擇好樣本后，應(yīng)將同一樣本等分用兩種檢測方法進行分析。每種方法中每種

28、標本都測定雙份，但兩次應(yīng)在不同的時間段進行測定。所有的分析都應(yīng)在同一天完成，最好在4小時以內(nèi)。結(jié)果分析：配對T檢驗 、線性回歸分析,線性范圍與可報告范圍的確定,建立線性范圍和容許區(qū)間：稀釋試驗、回歸分析驗證儀器的可報告范圍 ：分析至少三份不同濃度標準品或是落在可報告范圍的線性檢查物質(zhì)，每份標本分為兩份檢測。 1、如果這些結(jié)果都落在儀器的容許區(qū)間內(nèi)，則可確證可報告范圍。 2、如果結(jié)果不在可容許區(qū)間內(nèi)或者非線性，則應(yīng)選

29、擇可報告范圍內(nèi)更多的標準物來進行重復(fù)測定。3、如果結(jié)果無法驗證出儀器的可報告范圍，實驗室應(yīng)修改可報告范圍。,參考范圍的確定,來源：參考書、儀器/試劑廠家、自定參考范圍受儀器的多樣性、選擇的試劑、病人群體的影響。實驗室可以選擇建立自己的參考范圍或者是驗證生產(chǎn)廠家的參考范圍。理想狀態(tài)下，參考范圍應(yīng)該基于病人群體的年齡和性別確定。每個年齡和性別范疇內(nèi)，至少檢測120個個體。將年齡分組的方法之一就是每十歲為一組。為了將由于儀器或者試劑的不同