血細(xì)胞分析的溯源

1、血細(xì)胞分析的溯源及質(zhì)量保證,國際參考方法建立國際參考方法vs目前方法學(xué)的溯源血液學(xué)實驗室的質(zhì)量保證,血細(xì)胞分析的基本內(nèi)容,紅細(xì)胞計數(shù)白細(xì)胞計數(shù)血小板計數(shù)血紅蛋白濃度的測定白細(xì)胞分類,血球之父，行業(yè)鼻祖,1947年，華萊士.庫爾特先生獲得庫爾特原理的發(fā)明專利。迄今，全球有95%的血細(xì)胞分析儀采用庫爾特計數(shù)原理。1953年，全世界第一臺血細(xì)胞計數(shù)儀由庫爾特家族研制誕生。,溯 源,血細(xì)胞計數(shù) 顯微鏡計數(shù)→

2、庫爾特計數(shù)→多參數(shù)計數(shù)（物理、化學(xué)、免疫學(xué)法）相關(guān)問題：檢測結(jié)果大相徑庭(室間差異)，需標(biāo)準(zhǔn)化,歐洲血液學(xué)會召開了題為“血細(xì)胞分析技術(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)化”的研討會——1963年，里斯本1、成立國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會( International Council for Standardization in Haematology)2、解決室間差異3、建立血液細(xì)胞分析的國際參考方法4、建立溯源體系：各方法與國際參考方法比較,溯 源

3、,參考方法（Reference method）,一種可清楚和準(zhǔn)確描述的用于特定檢測的技術(shù)，該技術(shù)要有依據(jù)，可提供高度準(zhǔn)確和精密的實驗數(shù)據(jù)以評價其他實驗方法檢測結(jié)果的有效性。若有決定性方法，參考方法的準(zhǔn)確性必須與決定性方法進(jìn)行比較。參考方法應(yīng)溯源至一級計量標(biāo)準(zhǔn)并且須標(biāo)示不準(zhǔn)確度和不精密度。 （ICSH）,紅細(xì)胞國際參考方法（ ICSH， 1994年）,原理：電阻法（ ZBI 法）方法：采用Coulter ZBI電子細(xì)胞計數(shù)儀（單通

4、道、半自動），測定固定容量的顆粒數(shù)。用等滲緩沖生理鹽水作1/50000倍稀釋，測量和糾正重合誤差。單通道計數(shù)儀，能用于檢測通過小孔的紅細(xì)胞、白細(xì)胞，小孔為100µm和70µm，其長度：直徑比率為1。用水平壓力計控制稀釋細(xì)胞懸液的流量為1ml，與脈沖分析儀連接，設(shè)置閾值下限，微型計算機(jī)采集數(shù)據(jù)糾正重合誤差。對于新鮮血和乳膠顆粒重復(fù)測定精度可達(dá)0.35%。,☆技術(shù)要求：1、檢測系統(tǒng)所有血液流路部分都采用多年不會變形的石

5、英玻璃部件；2、定量部使用水銀壓力計；3、稀釋使用A 級的精密燒瓶和精密吸管；4、為了最大程度減少流體檢測中的誤差, 設(shè)計盡可能簡單。,紅細(xì)胞國際參考方法（ ICSH， 1994年）,利用不同濃度的標(biāo)本同時通過檢測部位的細(xì)胞數(shù)的比例不同的原理,以連續(xù)稀釋的檢測結(jié)果計算出無限稀釋倍率濃度時的檢測結(jié)果(在該濃度下,可認(rèn)為沒有細(xì)胞同時通過檢測部) ,并將該結(jié)果確定為所測標(biāo)本的“真值”。,紅細(xì)胞國際參考方法（ ICS

6、H， 1994年）,白細(xì)胞國際參考方法（ ICSH， 1994年）,ZBI 法： 只作一次稀釋，加入Zapoglobin后在1-5分鐘內(nèi)計數(shù)。其他同紅細(xì)胞計數(shù)要求,血小板的國際參考方法（ ICSH， 2001年）,原理：流式細(xì)胞儀間接計數(shù)血小板方法：采用EDTA抗凝全血，加特異性熒光標(biāo)單抗（CD41和CD61）染色血小板，被染色血小板在流式細(xì)胞儀上根據(jù)熒光強(qiáng)度和散射光，得出PLT和RBC比率，再根據(jù)血小板和紅細(xì)胞的比率,乘以

7、紅細(xì)胞參考方法所檢測得到的紅細(xì)胞真值來間接計算出血小板的真值。計數(shù)至少50000個血小板，精度可達(dá)2%。用血細(xì)胞計數(shù)盤直接計數(shù)血小板的方法，因為計數(shù)盤誤差為1%，若計數(shù)500個血小板，精度為5%。,測定溶解紅細(xì)胞中血紅蛋白轉(zhuǎn)化成氰化高鐵血紅蛋白的吸光度,血紅蛋白國際參考方法（ ICSH，1978年）,技術(shù)要求：1、分光光度計的質(zhì)量,2、石英比色杯的精度,3、標(biāo)本的稀釋精度,4、根據(jù)參考方法中的規(guī)定對試劑進(jìn)行調(diào)整,5、按照規(guī)

8、定使用清潔的過濾網(wǎng)對標(biāo)本進(jìn)行 測試前的過濾等。,血紅蛋白國際參考方法（ ICSH，1978年）,PCV 國際參考方法（微量離心法）,該法同精密毛細(xì)管法相比,從開始操作開始到往精密毛細(xì)管內(nèi)吸入紅細(xì)胞的步驟是相同的,但是計算時卻慎重地避開了精密毛細(xì)管的上部和下部僅取中央部分,通過國際參考方法測定該部位的血紅蛋白濃度。其結(jié)果與國際參考方法測得的全血的血紅蛋白濃度的比率為PCV。,血細(xì)胞分析結(jié)果的溯源性,使用國際參考方法對加

9、入抗凝劑EDTA2K的正常人新鮮血液進(jìn)行檢測,其結(jié)果作為該標(biāo)本各指標(biāo)的真值（A）。,使用要校準(zhǔn)的血細(xì)胞分析儀(下稱檢測系統(tǒng)) ,對同一標(biāo)本進(jìn)行檢測,并對檢測結(jié)果進(jìn)行修正使其與國際參考方法的檢測結(jié)果相同,該檢測系統(tǒng)(B) 與國際參考方法具有可溯源性,即A = B。問題：如果將某一區(qū)域內(nèi)所有相同的檢測系統(tǒng)(C) 都使用上述的同一份新鮮健康人血液進(jìn)行檢測,并把檢測結(jié)果修正到與國際參考方法一致,實際操作中會存在許多困難。,血細(xì)胞分析結(jié)果的溯源

10、性,用已溯源到國際參考方法的檢測系統(tǒng)(B) 檢測可以長期保存的固定后的血液,然后再用其他相同的檢測系統(tǒng)(C) 檢測該樣品,并把所得結(jié)果修正到與(B) 相同,此時,市場上相同的檢測系統(tǒng)便可以同與國際參考方法可溯源的儀器進(jìn)行間接溯源,即B = C。 ∵A = B ,B =C ∴A = C結(jié)論：市場上的檢測系統(tǒng)都可以與國際參考方法進(jìn)行溯源,血細(xì)胞分析結(jié)果的溯源性,用C 對其他不同檢測系統(tǒng)D 進(jìn)行溯源性校準(zhǔn)時, 可以假

11、定C 為A ,如果兩者之間使用新鮮健康人血液具有互換性的話,再用固化后的血液進(jìn)行調(diào)整使C = D , ∵ A =B ,B = C ,C = D ∴ A = D , 結(jié)論：不同檢測系統(tǒng)也與國際參考方法具有可溯源性。,血細(xì)胞分析結(jié)果的溯源性,繼續(xù)推進(jìn)此溯源鏈，就可以推進(jìn)各國、各地域的標(biāo)準(zhǔn)化,最終實現(xiàn)各單位間檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化。,血細(xì)胞分析結(jié)果的溯源性,溯源 儀器校正、檢定（宏觀）日常

12、工作質(zhì)量保證：室內(nèi)、室間質(zhì)控（微觀）,,1、質(zhì)量保證的過程2、室間質(zhì)量控制（PT方案）3、室內(nèi)質(zhì)量控制4、方法學(xué)評價/儀器比對,血液學(xué)實驗室的質(zhì)量保證,分析前：標(biāo)本的采集 （病員信息、采集過程）分析中：目的，原理，標(biāo)本要求，試劑，質(zhì)量控制，操作步驟，儀器保養(yǎng)、工作人員能力要求、結(jié)果解釋和誤差來源 分析后：影響測試結(jié)果的因素分析、取報告的時間(TAT）、投訴與反饋,質(zhì)量保證的過程,PT方案 (Proficiency tes

13、ting) 通過實驗室之間的比對判斷實驗室的檢測能力的活動。是室間質(zhì)量評價的重要方案，通過參加此項能力比對檢驗活動，可持續(xù)監(jiān)控實驗室分析性能，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和可比性，促進(jìn)實驗室質(zhì)量改進(jìn)。,室間質(zhì)量控制（PT方案）,能力比對分析（proficiency testing，PT）是室間質(zhì)量評價技術(shù)方案之一。它最初起源于美國，后來許多國家包括我國也采用了此模式，PT已成為全球性室間質(zhì)量保證系統(tǒng)（Extenalnal qu

14、ality assurance system，EQAS）的主要內(nèi)容。其方法是將未知標(biāo)本分發(fā)給各實驗室，對回報結(jié)果進(jìn)行分析，判斷實驗室獲得正確測定結(jié)果的能力，通過各實驗室間持續(xù)的比較，為衡量實驗室的質(zhì)量提供可靠的標(biāo)準(zhǔn)。為了保護(hù)病人的利益和公眾的福利，美國國會通過了 1988年臨床實驗室修正案（clinical laberatory improvement amendrnent，CLIA’88），強(qiáng)制性地將PT作為實驗室認(rèn)可的主要內(nèi)

15、容之一。,室間質(zhì)量控制（PT方案）,CLIA’88的PT方案規(guī)定，每年至少進(jìn)行3次PT調(diào)查，每次調(diào)查至少包括5個不同的質(zhì)控標(biāo)本，即在一年的時間內(nèi)，對于任一項目至少可得15個測定。對某個特定分析結(jié)果如落于規(guī)定限內(nèi)，則判為接受結(jié)果；否則為不可接受結(jié)果。對某一個接受結(jié)果，不再進(jìn)行優(yōu)劣分級。,室間質(zhì)量控制（PT方案）,從PT報告中可以獲得兩個重要信息：①你自己的實驗室與使用同一方法的其它實驗室結(jié)果的差異；②與做同一試驗，但使用不同方法的實驗

16、室結(jié)果比較的情況。,意 義,①評價實驗室的分析能力；②監(jiān)控實驗室可能出現(xiàn)的技術(shù)問題；③改正存在的問題；④改進(jìn)分析能力、試驗方法和同其它實驗室 的可比性；⑤教育和培訓(xùn)實驗室工作人員，以及評價工作人員的工作能力；③作為實驗室質(zhì)量保證的外部監(jiān)督工具（CLIA88要求）。,PT匯總報告的意義,①了解所有參加 PT的實驗室成績分布情況。定量 PT報告包括同組的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、結(jié)果分布和有關(guān)描述，以及結(jié)果的頻數(shù)分布。這些

17、數(shù)據(jù)可以比較同組之間 PT結(jié)果的差異和更多有用的信息。②監(jiān)測實驗室長期的工作狀態(tài)；指導(dǎo)實驗室工作人員的最低工作水平；提供實驗室準(zhǔn)確度和精密度的客觀證據(jù)。,質(zhì)控表的解釋 －－Westgard 規(guī)則BULL’S測試規(guī)則（移動平均數(shù)法 ）用病人標(biāo)本監(jiān)測質(zhì)量控制Delta檢查的使用,室內(nèi)質(zhì)量控制,多規(guī)則質(zhì)控技術(shù)（Westgard 規(guī)則）,實驗室工作人員有時對一些微小變化的質(zhì)控數(shù)據(jù)很難解釋，使用多規(guī)則質(zhì)控技術(shù)可揭示一些潛在的質(zhì)量問題。其中

18、有些規(guī)則對隨機(jī)誤差敏感，有些對系統(tǒng)誤差敏感。方法：即使用一組質(zhì)控規(guī)則來判定分析是否在控，Westgard使用五個不同的規(guī)則來判斷分析的可接受性，即在Levey－Jennings質(zhì)控圖規(guī)則的基礎(chǔ)上增加了R4s 、41s和10x規(guī)則，由此提高了系統(tǒng)誤差的檢出概率。質(zhì)控圖的制作方法同Levey－Jennings質(zhì)控圖的制作，即使用不同濃度的兩份質(zhì)控品，每日隨病人標(biāo)本測定，將結(jié)果分別點在相應(yīng)的質(zhì)控圖上。,Westgard 規(guī)則,（1）12s：

19、一個質(zhì)控結(jié)果超過2s。提示警告。（2）13s；一個質(zhì)控結(jié)果超過3s。提示存在隨機(jī)誤差。（3）22s：兩個連續(xù)質(zhì)控結(jié)果超過2s 。提示存在系統(tǒng)誤差。（4）R4s：同批兩個質(zhì)控結(jié)果之差的值超過4s，即一個質(zhì)控結(jié)果超過-2s，另一質(zhì)控結(jié)果超過了+2s。提示存在隨機(jī)誤差。（5）41s：一個質(zhì)控品連續(xù)四次的結(jié)果都超過+1s或-1s，或兩個質(zhì)控品連續(xù)兩次的測定結(jié)果都超過+1s或-1s 。提示存在系統(tǒng)誤差。（6）10X：十個連續(xù)的質(zhì)控結(jié)果在

20、平均數(shù)的一側(cè)。提示存在系統(tǒng)誤差。,BULL’S測試規(guī)則（移動平均數(shù)法 ）,移動平均數(shù)法是基于病人群體中紅細(xì)胞指數(shù)（MCV，MCH、MCHC）是穩(wěn)定的這個前提，對紅細(xì)胞指數(shù)進(jìn)行連續(xù)的統(tǒng)計學(xué)分析來監(jiān)測細(xì)胞計數(shù)儀操作性能的方法。。,建立移動平均數(shù)MCV，MCH，MCHC的可接受范圍：應(yīng)連續(xù)測定500個病人標(biāo)本，計算每個指標(biāo)的均數(shù)，可接受范圍確定為均數(shù)±3%。將這些范圍輸入細(xì)胞分析儀中，血細(xì)胞分析儀可將20個標(biāo)本定為一組計算出動態(tài)均

21、數(shù)并且確定這些動態(tài)均數(shù)是否落在可接受范圍內(nèi)。當(dāng)動態(tài)平均數(shù)超出可接受范圍時，儀器會提醒工作人員。如果一個動態(tài)平均數(shù)不可接受，應(yīng)該選出前20個標(biāo)本，因為這種方法對病人群體是敏感的。如果這20個標(biāo)本來自腎透析病人或者腫瘤病人，那么動態(tài)平均數(shù)的變化則是由于病人群體的問題而非儀器問題引起。一個真實的報警提示儀器存在著影響一個或多個紅細(xì)胞參數(shù)(RBC、H b、或Hct)的儀器問題。,BULL’S測試規(guī)則（動態(tài)平均數(shù)）,用病人標(biāo)本監(jiān)測質(zhì)量控制,用

22、EDTA抗凝標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)的優(yōu)點之一就是可以用它來監(jiān)測超過24小時的儀器的重復(fù)性。從早上的測試標(biāo)本中選出五個標(biāo)本，測定每個標(biāo)本的均值并且將每個標(biāo)本分成兩份，即相同的兩批標(biāo)本。第一批標(biāo)本用來檢測24小時內(nèi)儀器的精密度，這批標(biāo)本每四小時測一次，并計算出24小時內(nèi)的SD、CV。另外一批于冰箱保存24小時，用于監(jiān)測儀器的日間精密度，24小時后測定每一個樣本的均數(shù)。將初始均數(shù)和24小時測定均數(shù)進(jìn)行比較來決定均數(shù)的可接受范圍。每個實驗室應(yīng)建立自己

23、的可接受限。,Delta檢查,Delta檢查依賴對一個特定病人的連續(xù)檢測，通過對一個病人的最新檢測結(jié)果與最近一次檢測結(jié)果進(jìn)行比較，來檢測某一隨機(jī)誤差，這種檢測誤差的方法即是Delta檢查，它已是實驗室信息系統(tǒng)(LIS)所提供的最有價值的信息。,為確定在規(guī)定時間間隔內(nèi)某特定實驗（如Hb）的連續(xù)測定結(jié)果之間的可容許差別，應(yīng)建立一個容許限，這個容許限定義為LIS對異常結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記提示時的限度。計算Delta檢查的差別既可以用絕對值來表示，也可

24、以用百分?jǐn)?shù)來表示，無論用哪種方法，建立的Delta限應(yīng)當(dāng)是Delta檢查失敗時真正的結(jié)果改變不被標(biāo)記。如果仔細(xì)設(shè)置比較的時間范圍以及最大容許誤差，正確的結(jié)果就不會被標(biāo)記。因此，一個Delta檢查最可能的原因是標(biāo)本錯誤或者是隨機(jī)檢測錯誤。在血液學(xué)實驗室中某些項目具有非常小的個體內(nèi)變異尤其是紅細(xì)胞指數(shù)、血小板計數(shù)、凝血酶原時間和其他凝血研究等。當(dāng)這些參數(shù)出現(xiàn)一個Delta檢查時，結(jié)果報告之前應(yīng)進(jìn)行復(fù)查。,Delta檢查,方法學(xué)評價/儀器比對

25、,一種新方法或者新儀器的選擇，評價，改進(jìn)都必須遵循已建定的方案，每個實驗室應(yīng)設(shè)計出自己的一套方法或儀器的選擇，評價，改進(jìn)方案。,儀器選擇,成立專門的委員會來進(jìn)行選擇：成員包括血液學(xué)管理者、臨床實驗室專業(yè)人員、實驗室信息系統(tǒng)人員、質(zhì)量主管、生物醫(yī)學(xué)工程師和實驗室的主管性能評價調(diào)查 ：已使用該儀器人員、商家、文獻(xiàn)考慮因素：測試項目的費用，試劑，試劑有效期和保存條件，質(zhì)量控制，試驗的敏感性，特異性和線性，所需的儀器和設(shè)備，分析時間和所需要

26、的標(biāo)本類型。,分析的可靠性,在購買新的儀器或者引入新方法學(xué)的同時，實驗室必須通過一系列的試驗研究來證實該儀器和/或該方法的可操作性。評價：隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差,隨機(jī)誤差,檢查批內(nèi)精密度，根據(jù)病人標(biāo)本中被分析物的醫(yī)學(xué)決定水平選擇不同濃度的樣本，將同一病人標(biāo)本分為10到20等份作為同一批進(jìn)行檢測。計算其均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù) 。CV值≦生產(chǎn)廠家的CV值，則批內(nèi)精密度為可接受；如果測定的CV值大于生產(chǎn)廠家的CV值，則查出該數(shù)據(jù)并將其看作離

27、群值剔除并且重新計算CV。如果該CV值仍然不可接受，那么這種方法存在的隨機(jī)誤差或試劑和/或操作的認(rèn)為誤差都會影響精密度測定,系統(tǒng)誤差,系統(tǒng)誤差可通過新方法和一種已知是準(zhǔn)確的方法對同一病人標(biāo)本的測定結(jié)果來評價。將一份病人標(biāo)本分為幾等份（NCCLS建議至少40個樣本，100個更好）進(jìn)行檢測。樣本應(yīng)被隨機(jī)分配，以便能夠更具有臨床代表意義，理論上他們還應(yīng)該不同的病理條件。選擇好樣本后，應(yīng)將同一樣本等分用兩種檢測方法進(jìn)行分析。每種方法中每種

28、標(biāo)本都測定雙份，但兩次應(yīng)在不同的時間段進(jìn)行測定。所有的分析都應(yīng)在同一天完成，最好在4小時以內(nèi)。結(jié)果分析：配對T檢驗 、線性回歸分析,線性范圍與可報告范圍的確定,建立線性范圍和容許區(qū)間：稀釋試驗、回歸分析驗證儀器的可報告范圍 ：分析至少三份不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品或是落在可報告范圍的線性檢查物質(zhì)，每份標(biāo)本分為兩份檢測。 1、如果這些結(jié)果都落在儀器的容許區(qū)間內(nèi)，則可確證可報告范圍。 2、如果結(jié)果不在可容許區(qū)間內(nèi)或者非線性，則應(yīng)選

29、擇可報告范圍內(nèi)更多的標(biāo)準(zhǔn)物來進(jìn)行重復(fù)測定。3、如果結(jié)果無法驗證出儀器的可報告范圍，實驗室應(yīng)修改可報告范圍。,參考范圍的確定,來源：參考書、儀器/試劑廠家、自定參考范圍受儀器的多樣性、選擇的試劑、病人群體的影響。實驗室可以選擇建立自己的參考范圍或者是驗證生產(chǎn)廠家的參考范圍。理想狀態(tài)下，參考范圍應(yīng)該基于病人群體的年齡和性別確定。每個年齡和性別范疇內(nèi)，至少檢測120個個體。將年齡分組的方法之一就是每十歲為一組。為了將由于儀器或者試劑的不同