血細(xì)胞計(jì)數(shù)培訓(xùn)最終

1、試劑質(zhì)量檢驗(yàn)部——王賀,血細(xì)胞的分類(lèi)與計(jì)數(shù),血細(xì)胞的生成及分化,血液涂片的制備,1、每份樣本制作3張血涂片。要求所用玻片清潔、干燥、無(wú)塵，大小為25 mm×75mm，厚度為0.8～1.2mm。并有明確標(biāo)記。如果樣本中白細(xì)胞數(shù)量少時(shí)，需要制備更多血涂片（如6張）。2、使用EDTA－K2抗凝血液樣本時(shí)，應(yīng)在采集后4小時(shí)內(nèi)制備血涂片。在制片前，樣本應(yīng)充分混勻。注意，樣本不能冷藏。3、用楔形技術(shù)制備血涂片。在玻片近一端1/3處

2、，加一滴（約0.05ml）充分混勻的血液，握住另一張較狹窄的、邊緣光滑的推片，以30º～45º角使血滴沿推片迅速散開(kāi)，快速、平穩(wěn)地推動(dòng)推片至玻片的另一端。4、在1小時(shí)內(nèi)，用Romanowsky類(lèi)型染液染色；或在1小時(shí)內(nèi)，用無(wú)水甲醇（含水量﹤3%）固定后染色。,推片技巧,推片傾斜45°±1，推成血膜長(zhǎng)度25～35mm，寬度18～20mm，血膜四周留有空隙區(qū)，血膜終尾離玻片終端至少10mm，血膜均

3、勻，薄如蟬翼，尾端形如弧狀，迅速扇（搖）干，血膜具有頭、體、尾不同厚薄區(qū)域。此外，涂片時(shí)，還要考慮患者的血液狀態(tài)，如貧血程度、血液粘稠度、WBC或有核細(xì)胞多少等因素，調(diào)整推片技巧。,血膜至玻片邊緣約5mm,血膜至玻片一端約為總長(zhǎng)1/3,血涂片頭部，涂片厚,血涂片體部的檢查區(qū)域,血涂片尾部，涂片太薄,良好血涂片的要求,血膜至少長(zhǎng)25mm，至玻片兩側(cè)邊緣的距離至少為5mm。血膜邊緣要比玻片邊緣窄，且邊緣光滑，適用于油鏡檢查。血細(xì)胞從厚區(qū)

4、到薄區(qū)逐步均勻分布，末端呈方形或羽毛狀。血膜末端無(wú)粒狀、劃線或裂隙。所有這些情況會(huì)使白細(xì)胞集中在這些區(qū)域內(nèi)。在鏡檢區(qū)域內(nèi)，白細(xì)胞形態(tài)應(yīng)無(wú)人為異常改變。通常，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，抗凝血會(huì)造成白細(xì)胞形態(tài)的改變，如胞漿內(nèi)形成空泡，核分解破裂等。應(yīng)將抗凝血液保存時(shí)間的影響減小到最低限度。除部分淋巴細(xì)胞增生性疾病外，鏡檢區(qū)域內(nèi)破損白細(xì)胞量應(yīng)<2％。無(wú)人為污染。,瑞氏染色-姬姆薩（ Wright’s-Giemsa’s）混合染色,瑞氏染

5、色的染料配方濃度對(duì)細(xì)胞核著色程度適中,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和色澤清晰艷麗,對(duì)核結(jié)構(gòu)的識(shí)別較佳,但對(duì)胞漿著色偏酸,色澤偏紅,對(duì)細(xì)胞漿內(nèi)顆粒特別是嗜天青顆粒及嗜中性顆粒著色較差。 姬姆薩染色對(duì)胞漿著色能較好的顯示胞漿的嗜堿性程度,特別對(duì)嗜天青、嗜酸性、嗜堿性顆粒著色較清晰, 色澤純正,而對(duì)胞核著色偏深,核結(jié)構(gòu)顯示較差。 故采用以瑞氏染液為主，姬姆薩染液為輔的混合染色。,染色步驟,先用瑞氏染液將涂膜面充分覆蓋；稍等片刻再加姬姆薩染液2-3滴加減(

6、根據(jù)涂片上細(xì)胞多少及增升程度酌情而定)； 稍等1-2分鐘后,再加磷酸鹽緩沖液,加時(shí)應(yīng)緩慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液形成表面張力而終止染色液加入； 染色30-40分鐘； 分色：用自來(lái)水緩緩沖洗至少3分鐘以上,待干，勿用濾紙吸干,以免濾紙纖維污染涂片。,血涂片檢查的方法和程序,將血液充分混勻，盡早推成血片并染色。先用低倍或高倍鏡觀察。了解血片染色和細(xì)胞分布情況、有無(wú)血小板或紅細(xì)胞聚集（成串、成堆），尾部有無(wú)大型、成堆異

7、常細(xì)胞等；繼續(xù)用油鏡在涂片厚薄適中處瀏覽血片，仔細(xì)觀察紅細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板的形態(tài)，并估計(jì)其數(shù)量。如果觀察結(jié)果與儀器報(bào)告相符，不需進(jìn)行任何補(bǔ)充試驗(yàn)，即可按儀器測(cè)定的結(jié)果發(fā)出報(bào)告。如為貧血或其他血液病患者，其紅細(xì)胞數(shù)量及相關(guān)的指標(biāo)（如MCV、MCH、MCHC）紅細(xì)胞體積分布寬度（RDW）、直方圖或散點(diǎn)圖出現(xiàn)異常，則著重觀察紅細(xì)胞的大小、形態(tài)、內(nèi)涵物、著色性、大小一致性以及有無(wú)有核紅細(xì)胞等。如有異常，應(yīng)加以描述并報(bào)告。正常情況下，在血片

8、厚薄適中區(qū)域（每個(gè)紅細(xì)胞彼此相互接觸但雙不重疊），每個(gè)油鏡視野，約有血小板8～15個(gè)；或每10～30 個(gè)紅細(xì)胞見(jiàn)到一個(gè)血小板。,血細(xì)胞形態(tài)檢查的臨床意義,正常人的血液及造血器官中，各種血細(xì)胞的數(shù)量有一定的正常范圍，不同血細(xì)胞及細(xì)胞發(fā)育的不同階段有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 觀察血細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及其比例的變化是診斷造血系統(tǒng)疾病最基本的檢查方法。 造血系統(tǒng)疾病，引起血細(xì)胞形態(tài)學(xué)的量和質(zhì)的改變。血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查為臨床提供診斷依據(jù)。血細(xì)胞形態(tài)學(xué)

9、檢查應(yīng)包括外周血和骨髓兩部分。外周血細(xì)胞改變往往反映骨髓病變的重要信息，有利于診斷。,外周血細(xì)胞的主要成分,白細(xì)胞紅細(xì)胞血小板,白細(xì)胞計(jì)數(shù),WBC計(jì)數(shù)的正常范圍：4.0~10.0×109/L; WBC正常限度以下: 輕度減少(10.0～20.0×109/L), 中度增多(>20.0～40.0×109/L), 明顯增多(>40.0～80.0×109/L) 極度增多(>

10、80.0×109/L)。,白細(xì)胞分類(lèi),正常成人白細(xì)胞分類(lèi)范圍：,外周血中常見(jiàn)的五種白細(xì)胞,分葉核細(xì)胞大小為10～15µm。細(xì)胞核與細(xì)胞漿比率為1:3。細(xì)胞呈圓形或卵圓形。細(xì)胞核分葉，葉間有絲狀連接，分為2～5葉。核染色質(zhì)聚集。無(wú)核仁。細(xì)胞漿染成淡粉紅色，含大量特異性顆粒。桿狀核細(xì)胞大小為10～18µm。細(xì)胞核與細(xì)胞漿比率為1:1.5～1:2。細(xì)胞呈圓形或卵圓形。細(xì)胞核呈S形，C形,

11、U形或分葉形，可見(jiàn)峽狀染色質(zhì)。核染色質(zhì)粗顆粒狀聚集。無(wú)核仁。細(xì)胞漿豐富，染成粉紅色；含大量特異性顆粒，罕見(jiàn)嗜天青顆粒。,中性粒細(xì)胞,“成熟的粒系白細(xì)胞，具有彎曲、帶狀的核形， 核葉間沒(méi)有線樣絲（threadlike filament）形成，稱(chēng)為桿狀核；如果連接核葉之間的橋（bridge）內(nèi)有染色質(zhì)，這種橋就不算細(xì)絲，也是桿狀核”；“如果細(xì)胞核扭曲（twist）、纏繞，造成一部分核壓在另一部分核之上，以至整個(gè)核的外形看不清楚，

12、應(yīng)判為分葉核”,分葉核與桿狀核細(xì)胞的區(qū)分,中性粒細(xì)胞的毒性變化,所謂中性粒細(xì)胞的“毒性”變化，它是指白細(xì)胞在細(xì)菌、病毒等抗原，在毒素的刺激下，造成的一種形態(tài)學(xué)變化。如胞漿內(nèi)出現(xiàn)“毒性顆粒”、杜爾（Dohle）小體、空泡、脫顆粒以及胞質(zhì)腫脹等現(xiàn)象；胞核出現(xiàn)固縮（pyknotic）腫脹等。檢查這種變化，首先要制備厚薄適中，染色良好的血片。因?yàn)檠?，?xì)胞縮小，胞質(zhì)的內(nèi)容物不易看清；染色太深，會(huì)將正常中性粒細(xì)胞漿內(nèi)的顆粒也染得很深而粗，會(huì)誤

13、認(rèn)為毒性顆粒；胞質(zhì)內(nèi)的空泡和杜爾小體等也被掩蓋而不易看清。杜爾小體是一種常在胞漿邊緣部出現(xiàn)的淡藍(lán)色小體，實(shí)際上是一小塊含RNA 的胞質(zhì)，故亦稱(chēng)RNA 包涵體。此類(lèi)小體在重度細(xì)菌感染的血片中甚多見(jiàn)，但往往被檢驗(yàn)者忽略。在EDTA 抗凝血片中杜爾小體往往染呈灰色而不是淡藍(lán)色；如血液儲(chǔ)存過(guò)久，杜爾小體甚至?xí)А?注意，血液在體外如儲(chǔ)存過(guò)久，粒細(xì)胞等胞質(zhì)內(nèi)也會(huì)出現(xiàn)空泡，核也會(huì)扭曲、固縮，會(huì)誤認(rèn)為毒性變化。,細(xì)胞大小為

14、6～15µm。細(xì)胞核與細(xì)胞漿比率為5:1～2:1。細(xì)胞呈圓形或卵圓形。細(xì)胞核通常呈圓形或卵圓形；偶見(jiàn)核凹陷或輕度切跡。核染色質(zhì)散在致密或粗顆粒狀聚集；副染色質(zhì)無(wú)或少量。無(wú)核仁；有時(shí)，可見(jiàn)小的、淡的核小體。細(xì)胞漿少至中等量；淡藍(lán)色至中度嗜堿性；可見(jiàn)核周淡染區(qū)；有時(shí)有副核窩；小淋巴細(xì)胞無(wú)顆粒；大淋巴細(xì)胞的細(xì)胞漿較多，含少數(shù)粗大嗜天青顆粒。異型淋巴細(xì)胞細(xì)胞大小為10～25µm。細(xì)胞核與細(xì)胞漿比率為3:1

15、～1:2。細(xì)胞形態(tài)各異，呈圓形，卵圓形或不規(guī)則形。細(xì)胞核形態(tài)各異，呈圓形，卵圓形，凹陷形，折疊形，裂隙形或分葉形。核染色質(zhì)可以細(xì)致、中度致密或粗顆粒；副染色質(zhì)無(wú)或少量。核仁無(wú)或多個(gè)；大小和染色性各異。細(xì)胞漿中等至大量；染灰色、淡藍(lán)色或深藍(lán)色；可見(jiàn)細(xì)胞邊緣染色深，核周淡染；漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞常有核周淡染區(qū)或核窩；有時(shí)可見(jiàn)細(xì)小嗜天青顆粒；偶見(jiàn)空泡。,淋巴細(xì)胞,異型淋巴細(xì)胞,外周血中的淋巴細(xì)胞，是一類(lèi)高度異質(zhì)性的細(xì)胞。在病毒、毒素等抗

16、原的刺激下，其中有一部分會(huì)發(fā)生增殖并向漿細(xì)胞或幼稚細(xì)胞（母細(xì)胞）轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致多種多樣的形態(tài)變化。如細(xì)胞體積增大；胞質(zhì)量變多，藍(lán)染加深，有的含有空胞；核呈不規(guī)則的形狀，染色質(zhì)變得疏松，偶爾隱約可見(jiàn)核仁或絲狀分裂。凡此種種，經(jīng)常被一些缺乏經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)者誤認(rèn)為是白血病的幼稚細(xì)胞。過(guò)去由于對(duì)這類(lèi)淋巴細(xì)胞的本質(zhì)了解不夠，曾有很多命名。我國(guó)統(tǒng)稱(chēng)其為異常淋巴細(xì)胞，顯然欠妥。因?yàn)檫@類(lèi)細(xì)胞都是正常淋巴細(xì)胞對(duì)抗原物質(zhì)的反應(yīng)，與白血病等出現(xiàn)的惡性（異常）淋巴

17、細(xì)胞有根本性區(qū)別。目前國(guó)外一般稱(chēng)之為不典型淋巴細(xì)胞（atypicallymphocytes）, NCCLS則建議稱(chēng)其為變形淋巴細(xì)胞（variantlymphocytes）。,細(xì)胞大小為12～20µm。細(xì)胞核與細(xì)胞漿比率為4:1～2:1。細(xì)胞呈圓形，可有偽足。細(xì)胞核形態(tài)各異，呈圓形、卵圓形、馬蹄形、切跡形或分葉形。核染色質(zhì)輕度聚集。無(wú)核仁。細(xì)胞漿含藍(lán)灰色顆粒，少量空泡。,單核細(xì)胞,成熟型細(xì)胞大小為13～15µ

18、;m，幼稚型細(xì)胞大小為10～18µm。成熟型細(xì)胞核與細(xì)胞漿比率為1:3，幼稚型細(xì)胞核與細(xì)胞漿比率為1:2～2:1。細(xì)胞呈圓形或卵圓形。細(xì)胞核分葉狀，通常2-3葉，由細(xì)絲狀染色質(zhì)連接。分葉核和桿狀核的核染色質(zhì)致密、塊狀；幼稚型的核染色質(zhì)疏松、細(xì)致。無(wú)核仁。,嗜酸性粒細(xì)胞,嗜堿性粒細(xì)胞,★細(xì)胞大小為10～15µm?！锛?xì)胞核與細(xì)胞漿比率為1:2～1:3?！锛?xì)胞呈圓形或卵圓形?！锛?xì)胞核分葉狀，常被顆粒覆蓋。

19、★核染色質(zhì)聚集?！餆o(wú)核仁?！锛?xì)胞漿含粗大、致密、深紫色或黑色顆粒。,臨床意義,,外周血中的紅細(xì)胞,正常紅細(xì)胞直徑7.2~7.6mm，厚度2mm圓盤(pán)狀，兩面凹陷，中央較薄，著色較淺，在涂片中形態(tài)基本一致。正常RBC在體內(nèi)能經(jīng)受通過(guò)微血管的嚴(yán)重變形而不受損害。在高度粘稠血液中的RBC變成橢圓形，紅細(xì)胞膜圍繞著所含Hb旋轉(zhuǎn)，像坦克的踏板（Tread）。脾臟可篩選缺乏彈性的紅細(xì)胞、紅細(xì)胞異常變形或喪失彈性的紅細(xì)胞，并加強(qiáng)對(duì)這些紅細(xì)胞的

20、清除。 參考值：成年男性（4~5.5）×1012/L；成年女性（3.5~5.0）×1012/L,紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷,RBC/Hb、網(wǎng)織RBC、MCV、MCH、MCHC及RBC體積分布寬度（RDW）是判定貧血類(lèi)型重要依據(jù)：,(1)Hb/RBC比值：正常人：Hb/RBC比值為3gHb/L=100萬(wàn)RBC/ μL即3:1。AA、溶血性貧血及繼發(fā)性貧血等屬此類(lèi)。>3:1者即為大細(xì)胞高色素性貧血,5%。其網(wǎng)織RBC內(nèi)嗜

21、堿性網(wǎng)織增多，代償性功能減低者，低于正常水平。多見(jiàn)于AA，但有不典型AA（1/4）患者可有網(wǎng)織RBC增高。網(wǎng)織RBC計(jì)數(shù)1000個(gè)RBC中有多少網(wǎng)織RBC，以其%數(shù)表示，是一個(gè)比值數(shù)，不是絕對(duì)值。精確應(yīng)計(jì)算絕對(duì)值或用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)更為確切。 (3)MCV、MCH、MCHC反映RBC病理變化：可將貧血分為大細(xì)胞性貧血、正常細(xì)胞性貧血、小細(xì)胞低色素性貧血及單純小細(xì)胞性貧血（即小細(xì)胞性正常色素性貧血），其診斷標(biāo)準(zhǔn)及其病因。,影響RBC形態(tài)學(xué)

22、人為因素,(1)觀察RBC形態(tài)一般以外周血涂片較為可靠。 (2)RBC形態(tài)與排列（如重疊、緡錢(qián)狀）與涂片技術(shù)、涂片部位及厚薄有很大關(guān)系。這點(diǎn)在鏡檢時(shí)應(yīng)予注意。 (3)即是合格涂片，RBC形態(tài)依然與涂片部位及厚薄等多種因素有關(guān)：★如取涂片中心區(qū)域，RBC中心淡染，多 >1/3細(xì)胞面積大小;★取自涂片薄處或尾部，RBC形態(tài)誤給人以“球形”，失去雙凹盤(pán)形，中心淡染消失，所謂類(lèi)球形改變； ★取厚片或制片干燥過(guò)慢，R

23、BC未攤開(kāi)，收縮變形，甚至出現(xiàn)人工中心染色過(guò)淡等； ★取厚片RBC則重疊堆積，呈假“緡錢(qián)狀”，不便查清形態(tài)； ★玻片不清潔，油脂過(guò)多或骨髓脂肪過(guò)多，制片干燥不快，RBC則會(huì)形成人工的中心淡染區(qū)或空白區(qū)。,異常紅細(xì)胞,,外周血中的血小板,血小板是無(wú)核細(xì)胞，形如圓盤(pán)狀，直徑只有2～4μm，在血中存活10天左右。鏡下可見(jiàn)血小板多為圓形或橢圓形，亦有少數(shù)梭形及不整形者，可有翻轉(zhuǎn)及布朗運(yùn)動(dòng)，一般有1～3個(gè)突起，血小板可分為透明區(qū)與顆粒區(qū)，二者

24、沒(méi)有明顯分界，顆粒呈深藍(lán)色或藍(lán)綠色折光，散布于顆粒區(qū)內(nèi)，可不斷運(yùn)動(dòng)，透明區(qū)為淺綠色折光。小型血小板占33％～47％；中型血小板占44.3％～49％；大型血小板占8％～16％；巨型血小板占0.7％～2％。,在顯微鏡下觀察懸浮的微粒，或在無(wú)風(fēng)情形觀察空氣中的煙粒、塵埃時(shí)都會(huì)看到這種運(yùn)動(dòng)。這種運(yùn)動(dòng)會(huì)隨著溫度的升高而越激烈。 它是1827年植物學(xué)家R-布朗首先發(fā)現(xiàn)的。作布朗運(yùn)動(dòng)的粒子非常微小，直徑約10

25、-7～10-5米， 在周?chē)后w或氣體分子的碰撞下，產(chǎn)生一種漲落不定的凈作用力，導(dǎo)致微粒的布朗運(yùn)動(dòng)。,什么是布朗運(yùn)動(dòng)？,,血小板分布情況,功能正常的血小板在外周血涂片上?？删奂蓤F(tuán)或成簇。 原發(fā)性血小板增多癥，血小板集團(tuán)可以大至占滿(mǎn)整個(gè)油鏡視野。 再生障礙性貧血時(shí)，血小板集團(tuán)明顯減少。在血小板無(wú)力癥，則不出現(xiàn)聚集成堆的現(xiàn)象。,,細(xì)胞的手工計(jì)數(shù),血細(xì)胞計(jì)數(shù)板,,,計(jì)數(shù)池的規(guī)格,計(jì)數(shù)池共有9個(gè)大

26、方格；每個(gè)大方格內(nèi)分為16中方格，每一中方格又分為25小方格。,細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用方法,★實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目?！锞唧w操作：1. 將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板。2. 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿(mǎn)蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑小?#160;3. 計(jì)算板四大格

27、細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞計(jì)數(shù)原則（計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右）。,細(xì)胞懸液充池步驟,紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的操作方法,★2ml紅細(xì)胞稀釋液中加血10µl，混勻后，充入計(jì)數(shù)池，靜置3~5min后，在高倍鏡下，計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)正中及四角的5個(gè)中方格內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)。,★紅細(xì)胞數(shù)/L=N×25/5 ×10 ×106 × 200 =N×1010

28、 =N/100×1012,N：5個(gè)中方格內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù),★注意： 1.鏡下偶見(jiàn)有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液； 2.大方格間的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相差不應(yīng)超過(guò)10%，否則應(yīng)重新充池。,白細(xì)胞計(jì)數(shù)的操作方法,★白細(xì)胞稀釋液0.38ml中加血20µl，充分混勻后充入計(jì)數(shù)池，靜置2~3min，在低倍鏡下計(jì)數(shù)四角4個(gè)大方格內(nèi)白細(xì)胞