第三章儀器分析法簡單介紹-中國醫(yī)科大學(xué)網(wǎng)絡(luò)教育

1、一. 概述 (1) 比色法和可見分光光度法的特點(diǎn) 比色法: 在分析化學(xué)中, 利用比較 有色溶液顏色的深淺來測定物質(zhì)含 量的分析方法稱為比色法。過去大 多用眼睛觀察比較, 故又稱目視比 色法。,第二節(jié) 比色法和可見分光光度法,光電比色法(分光光度法): 隨著近代分析儀器的發(fā)展, 目前已 普遍使用光電比色計(分光光度計)通 過測量有色溶液對入色光的吸收程度 對物質(zhì)進(jìn)行分析,

2、稱為光電比色法(分 光光度法)。,與目視比色法相比, 光度法的特點(diǎn): ① 靈敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ② 準(zhǔn)確度較高; ③ 儀器設(shè)備較簡單, 操作簡便、 快速； ④ 應(yīng)用廣泛。,(2) 光的性質(zhì)和物質(zhì)的顏色 光的性質(zhì): 光是一種電磁波, 具 有波粒二象性。光的波動性可用波長來描述, 其單位常用納米(nm)表示, 波長越短, 能量越高。,

3、具有同一波長的光稱為單色光,由不同波長光組成的光稱為復(fù)合光。,互補(bǔ)色光: 若將兩種顏色的光按適當(dāng)?shù)?強(qiáng)度比混合可成白光, 那么這兩種光稱為互補(bǔ)色光。,物質(zhì)的顏色: 物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的。 當(dāng)一束白光通過溶液時, 若溶液對各 種色光都不吸收, 則白光全部通過, 溶液呈無色透明; 若各種色光幾乎全 被吸收, 則溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某種色光, 則溶液呈透過光的顏色, 也 就是說,

4、溶液呈吸收光的互補(bǔ)色光的 顏色。,例如, 白光通過CuSO4溶液時, 溶液 顏色為藍(lán)色。,吸收曲線: 為了精確表明溶液對不 同波長光的吸收情況, 可將不同波長 的單色光依次通過某一固定濃度的有 色溶液, 測量該溶液對各單色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波長為橫坐標(biāo), 吸光度為縱坐標(biāo)作圖所得曲線, 即為 吸收曲線, 或稱吸收光譜。,二、朗伯-比爾定律 (1) 朗伯-比爾定律,透光度(透光率T):,

5、吸光度(A):,朗伯-比爾定律:,此式表明: 當(dāng)一束平行的單色光通 過吸光物質(zhì)的均勻溶液時, 溶液的吸 光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成 正比。 K:比例常數(shù), 與入射光波長, 溶液 中吸光物質(zhì)的本性及溶液的溫度有 關(guān)。,(2) 吸光系數(shù) 當(dāng)b以cm, c以g/L為單位, K為吸光 系數(shù), 用符號a表示, 單位為L/g · cm A

6、=abc 當(dāng)b以cm, c以mol/L為單位時, K為 摩爾吸光系數(shù), 用符號ε表示, 單位 為L/ mol · cm A=εbc a與ε的關(guān)系:,比吸光系數(shù)( ): 指質(zhì)量濃度為 1%(g/mL), b為1cm時的吸光度值, 單位為mL/g · cm 同一物質(zhì)的ε與 之間的關(guān)系:,例1 一含F(xiàn)e

7、2+濃度為0.5mg/L的溶 液, 用鄰二氮菲顯色測定, 吸收池厚 度為2cm,在508nm處測得吸光度為 0.19, 求其摩爾吸光系數(shù)和比吸光系 數(shù)。,(3) 偏離朗伯-比爾定律的原因 標(biāo)準(zhǔn)曲線: 根據(jù)朗伯-比爾定律,當(dāng) 吸收池厚度不變, 以吸光度為縱坐 標(biāo), 濃度為橫坐標(biāo)作圖時, 應(yīng)得到一 條通過原點(diǎn)的直線, 稱為校正曲線或 標(biāo)準(zhǔn)曲線。,偏離朗伯-比爾定律的主要原因: ①

8、 定律僅適用于稀溶液 ② 化學(xué)變化引起的偏離(正偏離) ③ 非單色入射光引起的偏離(負(fù) 偏離),三. 方法和儀器 (1) 目視比色法 目視比色法: 用眼睛觀察比較溶液顏色深度以測量物質(zhì)含量的分析方法稱為目視比色法。,標(biāo)準(zhǔn)系列法的原理:,朗伯-比爾定律對標(biāo)準(zhǔn)系列法原理的解釋: A=εsbscs=εxbxcx,標(biāo)準(zhǔn)系列法的優(yōu)點(diǎn): ① 儀器簡單,

9、操作簡便,適宜于大批 試樣分析 ② 適宜于稀溶液中微量組分的測定 ③ 某些不完全符合朗伯-比爾定律 的顯色反應(yīng), 仍可用此法進(jìn)行測 定。標(biāo)準(zhǔn)系列法的缺點(diǎn): 準(zhǔn)確度較差。,(2) 光電比色法和可見分光光度法 ① 光電比色法的原理: 所用儀器為光電比色計。 光源→濾光片→一定波長范圍的近似單色光→有色溶液→透過光→光電池→檢流計的標(biāo)盤

10、,可見分光光度法所用的儀器稱為 分光光度計, 它是利用分光能力很強(qiáng)的棱鏡或光柵的原理, 作為單色器, 可連續(xù)獲得不同波長的單色光, 其波長范圍比用濾光片獲得的更窄。因此用分光光度計可連續(xù)測量某一定濃度有色溶液在不同波長下的吸光度, 從而可得其吸收光譜,通過吸收光譜可選擇最適宜的測定波長。,所以分光光度計采用適當(dāng)?shù)墓庠?和檢測器, 使測量的范圍不只局限于 可見光區(qū)。如用紅外光作為光源成 為紅外分光光度法; 用紫外線作

11、為光 源稱為紫外分光光度法。,② 光電比色計和可見分光光度計的 基本部件,a. 光源 要求: 光源須具有足夠的輻射強(qiáng)度, 且穩(wěn)定性好。 鎢燈是可見分光光度計常用 的光源。,b. 單色器 光電比色計: 用濾光片獲得單色光。 選擇濾光片的原則是: 濾光片最易 透過的光應(yīng)是有色物質(zhì)最易吸收的 光, 即濾光

12、片的顏色與溶液的顏色應(yīng) 為互補(bǔ)色; 也可以使用不同的濾光片 測量同一有色溶液的吸光度, 測得吸 光度最大時所用的濾光片就是最適 宜的濾光片。,分光光度計: 單色器由棱鏡或光柵、狹縫和準(zhǔn)直鏡等部分組成。 棱鏡: 色散元件, 有石英或玻璃兩種, 它們對不同波長光具有不同的折射率。石英棱鏡對紫外光分光效果好, 玻璃棱鏡對可見光分光效果好, 因為玻璃對紫外光有吸收, 故不能用于紫外光區(qū)。,光柵:色散元件,

13、利用光的衍射和干 涉原理制成。當(dāng)白光通過密刻平行條 痕的光柵后, 將不同波長的光色散成 連續(xù)光譜。具有波長范圍寬、色散均 勻、分辨本領(lǐng)高等優(yōu)點(diǎn)。,c. 吸收池(比色皿) 用于盛裝被測試液和參比溶液。 按制作材料不同分為石英吸收 池和玻璃吸收池。,d. 檢測器 作用: 是將光強(qiáng)度信號轉(zhuǎn)換為可 測電信號, 常見檢測器有光電池和 光電管。 光電池:

14、國產(chǎn)581-G型光電比色 計及72型分光光度計。,優(yōu)點(diǎn): 光電池靈敏度較高, 產(chǎn)生的光電 池不需要經(jīng)過放大便可直接用 靈敏檢流計測量。缺點(diǎn): 光電池經(jīng)強(qiáng)光照射或連續(xù)使用時 間過長, 易產(chǎn)生“疲勞現(xiàn)象”, 導(dǎo)致 靈敏度降低, 遇此情況, 應(yīng)暫停使 用并避光放置, 待其復(fù)原后再用。,光電管: 國產(chǎn)721型分光光度計,e.

15、指示器,(3) 常用光電比色計和分光光度計 光電比色計: 國產(chǎn)581-G型, 儀器通 常配有紅色、綠色、藍(lán)色三塊濾光 片, 其透過光的最大波長分別在650、 530和440mm左右。,可見光光度計: 國產(chǎn)721型分光光度計,四、顯色反應(yīng)及其影響因素 顯色反應(yīng): 將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩?化合物的反應(yīng)稱為顯色反應(yīng)。 顯色劑:使被測組分顯色的試劑稱 為顯色劑。

16、,(1) 對顯色反應(yīng)的要求 ① 選擇性好 ② 靈敏度高 ③ 有色化合物組成恒定 ④ 有色化合物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 ⑤ 顯色劑在測定波長處無明顯吸收,(2) 顯色劑 顯色劑可分為無機(jī)顯色劑和有機(jī)顯 色劑兩大類。由于大多數(shù)有機(jī)顯色 劑能與金屬離子形成穩(wěn)定的有特征 顏色的螯合物, 靈敏度較高, 選擇性 也較好。因此, 在比色分析和光度分

17、 析中主要選用有機(jī)顯色劑。,兩種常用的有機(jī)顯色劑： ① 鄰二氮菲 其結(jié)構(gòu)式為 這是目前廣泛用于測定Fe2+的較好的顯色劑。先用鹽酸羥胺把待測試液中的Fe3+還原為Fe2+ ,然后在pH5~6的條件下,與鄰二氮菲反應(yīng),生成穩(wěn)定的橙紅色配合物，配合物的λmax為508nm.反應(yīng)是特效的,靈敏度也較高，摩爾吸光系數(shù)ε為1.1×104L/mol.cm。,②. 雙硫腙 其結(jié)構(gòu)式為,(3) 影響顯色反應(yīng)的因素：

18、 ① 顯色劑的用量： 顯色反應(yīng)表示式: M+R MR (被測組分)(顯色劑)(有色配合物) 顯色劑的用量應(yīng)當(dāng)適宜,其用量是 通過實(shí)驗確定。,實(shí)驗方法為：固定被測組分的濃度和其它條件,改變顯色劑在溶液中的濃度cR,分別測量吸光度(A),繪制A-cR曲線。,② 溶液的酸度 適宜酸度范圍確定方法： 固定顯色劑和被測組分的濃度,

19、 改變?nèi)芤旱膒H值,分別測量吸光度, 繪制A- pH曲線。曲線平坦部分所 對應(yīng)的pH值即為適宜的酸度范圍。,③ 顯色時間 作吸光度-時間曲線, 確定適宜的 顯色時間。 ④ 顯色溫度 ⑤ 溶劑的性質(zhì)⑥ 共存離子的干擾及其消除,消除共存離子干擾的方法： a.控制溶液的酸度 b. 加入掩蔽劑 c. 分離干擾離子,五、光度測量條件

20、的選擇 (1) 選擇合適波長的入射光 ① 選被測有色物質(zhì)的λmax為入射 光 ② 如在λmax處顯色劑或干擾組分 有明顯的吸收, 則應(yīng)選靈敏度較 低但能避免干擾的適宜波長的光 作為入射光。,(2) 選擇適宜的參比溶液 ①. 當(dāng)被測溶液、顯色劑及所用其他試劑均無色,可用純?nèi)軇┳鳛閰⒈热芤? 稱為溶劑空白。

21、 ②. 當(dāng)顯色劑無色而被測試液中存在其他有色離子時,可用不加顯色劑的被測試液作為參比溶液,稱為試樣空白。 ③. 當(dāng)顯色劑或其他試劑有色,可用顯色劑或其他試劑作為參比溶液,稱為試劑空白。,④. 用不含被測組分的試樣, 在相同條件 下與被測試樣同時進(jìn)行處理, 測吸光 度時以前者所得溶液為參比溶液, 稱 為平行操作空白。如臨床上進(jìn)行某 種藥物濃度的監(jiān)測,取正常人血樣和 待測血藥

22、濃度的血樣在相同條件下 處理, 用前者得到的溶液作為參比溶 液。,(3) 控制適當(dāng)?shù)奈舛茸x數(shù)范圍 適宜讀數(shù)范圍: 吸光度A在0.15~1.0內(nèi)， 或透光度T值在0.10~0.70內(nèi)。 六.比色法和可見分光光度法的定量方法 (1) 校正曲線法(適用于經(jīng)常性的批量分 析） (2) 標(biāo)準(zhǔn)對比法（標(biāo)準(zhǔn)品對照法） 此法適宜于非經(jīng)常性的分析工作。,當(dāng)校正曲線通過

23、零點(diǎn)時,將樣品溶液和一標(biāo)準(zhǔn)溶液在選定實(shí)驗條件下顯色,測得吸光度分別為Ax和As,標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為cs,則樣品溶液的濃度cx可按下式求得：,在藥物分析中, 為了測定方便, 通常 使被測試樣稱樣量和稀釋倍數(shù)與標(biāo)準(zhǔn) 試樣一致,則被測試樣的含量ω可由測 量的兩者吸光度的比求得,即,另外,在藥物分析中,還常用與標(biāo)準(zhǔn) 品的比吸光系數(shù)比較進(jìn)行含量測定。 如被測試樣稱樣量和稀釋倍數(shù)與標(biāo)準(zhǔn) 品一致,在相同條件下,測得被測試樣

24、與標(biāo)準(zhǔn)品的比吸光系數(shù)分別為 和 則試樣質(zhì)量濃度 為,七. 比色法和可見分光光度法在醫(yī)學(xué)檢 驗中的應(yīng)用 全血中鐵的測定 全血中鐵的測定需要先將各種形式的鐵轉(zhuǎn)化為游離的Fe3+離子。通常用消化法,蛋白質(zhì)用鎢酸沉淀除去,取無 蛋白的濾液,在一定條件下加KSCN顯色劑,生成血紅色配合物,反應(yīng)式為,在520nm波長處或用藍(lán)綠色濾光片