dna連接酶

1、基因工程的基本內容,Gene engineering,基因決定性狀（一）,青霉菌能產生對人類有用的抗生素——青霉素,基因決定性狀（二）,家蠶能夠吐出蠶絲為人類利用,基因決定性狀（三）,豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮,定向基因改造設想,設想一,能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？,能否讓細菌“吐出”蠶絲？,設想二,能否讓微生物產生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？,設想三,經過多年的努力，科學家于20世紀70年代創(chuàng)立了可以定向改造

2、生物的新技術——基因工程。,基因對性狀的控制,1.通過控制蛋白質分子的結構來影響性狀,定向改造生物的依據,基因工程概念,基因工程：在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內表達，產生出所需要的基因產物。,基因操作的工具,基因的剪刀——限制性內切酶,基因工程過程示意圖,基因的針線——DNA連接酶,基因的運輸工具——運載體,基因工程過程示意圖,

3、①從細胞中分離出DNA,,,②限制酶截取DNA片斷,③分離大腸桿菌中的質粒,④ DNA重組,⑤用重組質粒轉化大腸桿菌,⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因,返 回,限制性內切酶,分布：主要在微生物中。特點：特異性，即識別特定核苷酸序列， 切割特定切點。結果：產生黏性未端（堿基互補配對）。舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識別 GAATTC序列，并在G和A之間切開。,返 回,DNA連接酶,連接酶的作用：將互補配對的兩個黏

4、性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。連接的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵。DNA連接酶的作用過程,返 回,運載體,作用：將外源基因送入受體細胞。條件：能在宿主細胞內復制并穩(wěn)定地保存。具有多個限制酶切點。具有某些標記基因種類：質粒、噬菌體和動植物病毒。質粒的特點,能將外源基因送入受體細胞的工具就是運載體。,返 回,基因操作的基本步驟,提取目的基因,目的基因與運載體結合,將目的基因導入受體細胞,目的基因的檢測和表達

5、一,目的基因的檢測和表達二,提取目的基因,將需要的基因從供體生物的細胞內提取出來。,,,取 出DNA,用限制酶切斷DNA,目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。,返 回,提取目的基因的方法（一）,直接分離基因——鳥槍法,將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運載體將這些片段都運載到受體生物的不同細胞中去。只要有一個細胞獲得了需要的目的基因并得以表達，

6、基因工程就算成功了?！　≡摲ㄗ畲蟮娜秉c是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉移到原核生物中去。,,,用限制酶切成許多片斷,下一頁,,提取目的基因的方法（二）,人工基因合成法,反轉錄法：直接合成法： 用游離的脫氧核苷酸 直接合成相應的基因。,DNA合成儀,PCR擴增儀,返 回,目的基因與運載體結合,返 回,,目的基因,重組DNA（質粒）,將目的基因導入受體細胞并擴增,,,將目的基因導入受體細胞

7、,將受體細胞進行擴增,返 回,基因工程中常用的受體細胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌和動植物細胞等。,目的基因的檢測和表達（一）,為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細胞來接受不多的目的基因。,細菌的檢測：將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產物。,返 回,目的基因的檢測和表達（二）,返 回,多細胞生物的檢測：將每個受體細胞單獨培養(yǎng)并誘導發(fā)育成完整個體，檢測這些個體是否攝入目的基因，攝入的基因是

8、否表達（是否表現出相應的性狀）。,,（轉基因生物）,,提取目的基因,目的基因與運載體結合,將目的基因導入受體細胞,目的基因的檢測和表達,小 結,練習,1988年5月中國青年科學家陳炬成功地把人的干擾素基因移植到煙草的DNA分子上，轉化后的煙草具備了抗病毒能力。,1.人的基因之所以能接到植物細胞中，物質基礎是 。2.煙草能抗病毒是因為體內產生了 。3.以上事實可說明哪些問題？,練習,返回,二、基因工程的成果與

9、發(fā)展前景,1.醫(yī)藥衛(wèi)生方面，基因工程有哪些應用和前景？,2.農業(yè)和食品工業(yè)方面，基因工程有哪些應用 和前景？,3.環(huán)境保護方面，基因工程有哪些應用和前景？,4.你想像中未來的基因工程會有怎樣的發(fā)展？,1.基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生,Ａ、生產基因工程藥品,工程菌：用基因工程方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系。,Ｂ、基因診斷,back,DNA探針：利用DNA分子雜交原理,外源正?；驅氚屑毎?與基因治療,back,2.基因工程與農牧

10、業(yè)、食品工業(yè),A、在農業(yè)方面，可獲得高產、穩(wěn)產和具優(yōu)良品質的農作物；培育出具各種抗性的作物新品種。,B、在畜牧業(yè)上，可獲得人們需要的轉基因動物,顯微注射技術：,C、為人類開辟新的食物來源,3.基因工程與環(huán)境保護,back,檢測病毒：用DNA探針（由特定DNA片段制成）,凈化環(huán)境：創(chuàng)造出“超級細菌”；吞噬汞和降解土壤中DDT的細菌；凈化鎘污染的植物；構建新的殺蟲劑。,袁隆平的夢想,我做過這樣一個夢：有一天傍晚，我和我的助手走過我們的試驗田

11、，發(fā)現水稻長得象高粱那么高，穗子有掃帚那么長，籽粒有花生那么大……理論上，光能利用率可以達到5%，而現在只有1% ……,讓農作物成為“靈丹妙藥”轉基因西紅柿與SARS抗體基因治療面面觀餐桌上的轉基因食品2050年——基因工程和我的生活,基因工程——潛在的危險,back,1990年美國國立衛(wèi)生研究院治愈一位“重癥聯合免疫缺陷綜合癥”的4歲女孩,基因治療：用一個正常的基因來代替缺陷基因,ADA基因缺陷ADA：腺苷酸脫氨酶,bac

12、k,基因結構的基本單位相同密碼子相同蛋白質合成方式相同,基因治療（gene therapy）是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的。也就是將外源基因通過基因轉移技術將其插入病人的適當的受體細胞中，使外源基因制造的產物能治療某種疾病?；蛑委熤饕詢煞N策略達到治療目的。其一是正常基因來糾正突變基因，也就是在原位修復缺陷基因的直接療法，此乃理想的基因治療策略，由于多種困難，目前尚未實現；其

13、二是用正?；虿惶娲虏』虻拈g接療法，此法較前者難度小，也是目前眾多主張采用的策略，并已付諸臨床實踐。而就基因轉移的受體細胞不同，基因治療又有兩種途徑,即生殖（種系）細胞基因治療和體細胞基因治療。,back,日本科學家近日發(fā)現，寄生在昆蟲體內的細菌基因可進入寄主昆蟲的細胞核，并通過寄主昆蟲把細菌基因遺傳下去。這一發(fā)現有可能使人們重新認識生物進化論學說，高度警惕轉基因技術的風險。包括人類在內，各種生物的染色體內都有可能汲取了寄生或共生在

14、生物體內的微生物的基因。不同種類生物之間轉基因現象范圍不斷擴大的事實，對了解生物進化的原因和病原體相互作用原理將大有幫助。同時也向人類發(fā)出警告：轉基因技術存在風險，導入基因有可能擴散到其它生物。,生物安全的特點：轉基因生物體對人類和環(huán)境的影響是長期的，不可預見的，很多影響可能產生滯時效應，不像非生物影響那樣隨時間而減小，隨距離而減弱，大量的轉基因生物是以特殊的生命形式，以超過自然進化千百倍的速度介入到自然界來，潛在的危險可能會更大。,b

15、ack,DNA連接酶的作用原理,主 頁,一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點上將DNA 分子切斷。目前已發(fā)現的限制酶有200多種。,返 回,DNA連接酶的作用過程,返 回,質 粒,返 回,質粒的特點,細胞染色體外能自主復制的小型環(huán)狀DNA分子；質粒是基因工程中最常用的運載體；最常用的質粒是大腸桿菌的質粒；存在于許多細菌及酵母菌等生物中；質粒的存在對宿主細胞無影響；質粒的復制只能在宿主細胞內完成

16、。,返 回,小 結,基因工程的基本內容,,基因操作的基本步驟,,基因操作的工具,,限制性內切酶,DNA連接酶,運載體,概念辨析,遺傳信息—密碼子—遺傳性狀,限制性內切酶—DNA連接酶—DNA聚合酶,目的基因—供體細胞—受體細胞—轉化細胞,復制—轉錄—翻譯,根據蛋白質合成中遺傳信息傳遞的過程填表：,A,遺傳信息在？DNA-a DNA-bmRNA tRNA,,,亮氨酸,HIV,next,back,如果想要

17、獲得一定的基因，可以有哪些途徑？,常用的是“鳥槍法”——直接剪切供體細胞DNA分子,1、以信使RNA為模板逆轉錄并互補成DNA分子,2、根據已知的氨基酸序列推測出基因的核苷酸序列，直接合成DNA分子,直接分離基因——,人工合成基因——,,基因操作的工具,聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。PCR技術的基本原理　類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶

18、序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNT

19、P為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。標準的PCR反應體系：　　　10×擴增緩沖液 　 10ul　　　4種dNTP混合物 　 各200umol/L　　　引物 　　　　 　 各10～

20、100pmol　　　　模板DNA 　　　 　0.1～2ug　　 　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　加雙或三蒸水至 　100ul　　PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+　　引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互