六溴環(huán)十二烷腦發(fā)育期暴露對(duì)TR信號(hào)傳導(dǎo)的影響及神經(jīng)毒性效應(yīng)研究.pdf

1、六溴環(huán)十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCD)作為一種添加型阻燃劑，目前已經(jīng)成為環(huán)境中無(wú)處不在的污染物，并且在人體血液甚至兒童體內(nèi)都可以被檢測(cè)到。現(xiàn)有的一些研究已證實(shí)HBCD具有內(nèi)分泌干擾作用及神經(jīng)毒性作用，它可以損害大腦中少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，損傷大腦的學(xué)習(xí)和記憶功能，還會(huì)引發(fā)異常的自發(fā)性行為。尤其是處于腦發(fā)育期的兒童更是成為了HBCD暴露和毒性作用的主要人群。為了研究HBCD腦發(fā)育期暴露對(duì)甲狀腺激素受體信號(hào)

2、傳導(dǎo)的影響及神經(jīng)毒性效應(yīng)，本論文根據(jù)發(fā)育期兒童為HBCD暴露的高風(fēng)險(xiǎn)人群的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)選取新生3天的SD大鼠(PND3)；依據(jù)環(huán)境真實(shí)暴露水平設(shè)計(jì)HBCD的暴露劑量，設(shè)置對(duì)照組和10、50、100、300μg/kg的HBCD染毒組等5個(gè)組別：根據(jù)大鼠腦發(fā)育的特點(diǎn)，將暴露時(shí)間劃分為21天、42天、90天等3個(gè)不同的腦發(fā)育期時(shí)間節(jié)點(diǎn)；通過(guò)對(duì)動(dòng)物神經(jīng)行為、甲狀腺激素水平、甲狀腺激素核受體(TR)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的相關(guān)基因表達(dá)、神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)酶活性等

3、幾個(gè)方面指標(biāo)的測(cè)試，嘗試從動(dòng)物個(gè)體、生化指標(biāo)及基因水平揭示HBCD甲狀腺激素干擾的機(jī)制與神經(jīng)毒性效應(yīng)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：
　　 1、利用Morris水迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分別對(duì)21d和90d兩個(gè)暴露時(shí)間節(jié)點(diǎn)下大鼠的神經(jīng)行為進(jìn)行了檢測(cè)。Morris實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，21d的短期暴露后，對(duì)于逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)兩個(gè)指標(biāo)，10μg/kg的低劑量染毒組和300μg/kg的高劑量染毒組能夠促進(jìn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并且影響顯著(P<0.05)

4、。而平臺(tái)所在象限活動(dòng)以及調(diào)換平臺(tái)后的逃避潛伏期兩個(gè)指標(biāo)顯示300μg/kg的高劑量染毒組能夠促進(jìn)大鼠記憶和再學(xué)習(xí)能力，并且呈現(xiàn)顯著性(P<0.05)。經(jīng)過(guò)90d的暴露后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與21d較為一致，不同的是50μg/kg染毒組卻表現(xiàn)出損害大鼠記憶和再學(xué)習(xí)的能力并且呈現(xiàn)顯著性(P<0.05)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，21d的短期暴露后，活動(dòng)總路程的指標(biāo)顯示出50～300μg/kg染毒組大鼠運(yùn)動(dòng)活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)；中央活動(dòng)路程指標(biāo)顯示出1

5、0μg/kg染毒組大鼠有顯著性的心理焦慮(P<0.05)，但是，這種影響隨著大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育逐漸減弱，暴露90d后，已經(jīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2、利用125I-甲狀腺激素與抗血清放射免疫分析法測(cè)定血清中甲狀腺激素相關(guān)指標(biāo)的變化，包括：TT3、TT4、FT3、FT3、TSH等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)21d短期暴露，各染毒組大鼠血清中TT3、TT4、FT3、FT4的濃度均顯著升高(P<0.05)，TSH濃度降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義(P>0.05)。經(jīng)過(guò)42d暴露，10μ g/kg的染毒組大鼠血清中TT3、TT4、FT3、FT4的濃度均升高，并且FT3、FT4的濃度顯著升高(P<0.05)：染毒組血清中TSH的濃度下降，10、50、300μ g/kg染毒組呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。經(jīng)過(guò)90d暴露，染毒組大鼠出現(xiàn)了血清中TT3、TT4、FT3、FT4的濃度均上升的趨勢(shì)，其中各染毒組的TT4濃度顯著升高(P<0.05)，50μg/kg染毒組的FT4濃度顯著升高(

7、P<0.05)，50和100μg/kg染毒組的TT3、FT3濃度顯著升高(P<0.05)；10μg/kg染毒組的TSH濃度顯著降低(P<0.05)，其他各染毒組中的TSH濃度均顯著升高(P<0.05)。
　　 3、利用real-time PCR法定量測(cè)定大鼠海馬TR傳導(dǎo)過(guò)程相關(guān)基因表達(dá)水平的變化，包括3種不同構(gòu)型的TR基因TRα1、TRα2、TRβ1；參與甲狀腺激素與TR結(jié)合的復(fù)合物與甲狀腺激素應(yīng)答元件(TRE)的轉(zhuǎn)錄基因BTE

8、B；TR信號(hào)調(diào)控的下游神經(jīng)功能基因RC3、NGF；以及神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶相關(guān)的功能基因MAO-A、MAO-B、ChAT等。TR基因檢測(cè)結(jié)果顯示，各暴露時(shí)間染毒組大鼠海馬TRα1 mRNA的表達(dá)水平都有上升趨勢(shì)，其中暴露42d，50μg/kg染毒組和暴露90d，300μg/kg染毒組TRα1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；暴露21d和90d，各染毒組大鼠海馬TRα2 mRNA的表達(dá)水平上升，暴露42d，各染毒組表達(dá)水平下降，10、50和30

9、0ug/kg染毒組呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05)；暴露21d，10ug/kg染毒組大鼠海馬TRβ1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，暴露42d和90d，各染毒組大鼠海馬TRβ1 mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中暴露42d，100-300ug/kg染毒組和暴露90d，50-300ug/kg染毒組呈現(xiàn)顯著升高(P<0.05)。
　　 BTEB基因的檢測(cè)結(jié)果顯示，暴露21d，各染毒組大鼠海馬BTEB mRNA的表達(dá)水平均顯著

10、降低(P<0.05)；暴露42d染毒組BTEB mRNA的表達(dá)有降低趨勢(shì)，暴露90d染毒組BTEB mRNA的表達(dá)有升高的趨勢(shì)，兩個(gè)時(shí)間暴露均未有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NGF、RC3基因檢測(cè)結(jié)果顯示，暴露42d染毒組大鼠海馬NGF mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，暴露21d和90d的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；暴露21d和90d染毒組大鼠海馬RC3 mRNA表達(dá)有下降趨勢(shì)，暴露42d有升高趨勢(shì)，其中21d、10ug/kg染毒組表達(dá)顯

11、著降低(P<0.05)。
　　 MAO-A、MAO-B、ChAT等基因的檢測(cè)結(jié)果顯示，暴露21d染毒組MAO-AmRNA表達(dá)有下降趨勢(shì)，暴露90d，染毒組MAO-A mRNA表達(dá)有升高趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；染毒組MAO-B mRNA表達(dá)在暴露21d和90d有升高趨勢(shì)，暴露42d有降低趨勢(shì)，并有100ug/kg染毒組表達(dá)顯著降低(P<0.05)。暴露21d，100ug/kg染毒組ChAT mRNA表達(dá)顯著降低(P

12、<0.05)；暴露42d，染毒組ChAT mRNA表達(dá)升高，并且50-100μg/kg染毒組的表達(dá)顯著升高(P<0.05)：暴露90d，10染毒組表達(dá)顯著升高(P<0.05)。
　　 4、利用分光光度法、熒光定量法和ELISA試劑盒法測(cè)定大鼠腦中單胺、膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)含量及其相關(guān)代謝酶活性，單胺類包括DA、NE、5-HT神經(jīng)遞質(zhì)及MAO酶；膽堿類包括Ach神經(jīng)遞質(zhì)及AchE、ChAT等代謝酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在單胺能系統(tǒng)中，暴露21

13、d，100-300ug/kg染毒組DA含量顯著降低(P<0.05)，50～100ug/kg染毒組NE含量顯著降低(P<0.05)，300ug/kg染毒組5-HT含量顯著降低(P<0.05)，50-300ug/kg染毒組MAO活性升高；暴露42d，染毒組DA含量升高，其中10和100ug/kg染毒組DA含量顯著升高(P<0.05)，染毒組NE含量顯變化不明顯，50-100μg/k染毒組5-HT含量顯著升高(P<0.05)，MAO活性變化無(wú)

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；暴露90d，300ug/kg染毒組DA含量顯著降低(P<0.05)，100ug/kg染毒組NE含量顯著降低(P<0.05)，300ug/kg染毒組5-HT含量顯著升高(P<0.05)，MAO含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 在膽堿能系統(tǒng)中，經(jīng)HBCD不同暴露時(shí)間，染毒組Ach含量水平均有下降趨勢(shì)，其中21d、100-300μg/kg染毒組Ach的含量顯著降低(P<0.05)；暴露21d和4

15、2d，染毒組AchE活性有升高趨勢(shì)，并且300μ g/kg染毒組AchE活性顯著升高(P<0.05)，暴露90d，AchE活性變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；暴露21d，染毒組ChAT活性變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，暴露42d，10ug/kg染毒組ChAT活性顯著升高(P<0.05)，暴露90d，100～300μg/kg染毒組ChAT活性顯著降低(P<0.05)。
　　 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出結(jié)論：
　　 1、

16、動(dòng)物神經(jīng)行為實(shí)驗(yàn)表明21d和90d的HBCD暴露可以引起大鼠的神經(jīng)興奮，對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶以及再學(xué)習(xí)能力有一定促進(jìn)作用，極低劑量(10μg/kg)和高劑量(300μg/kg)更能促進(jìn)這種作用的發(fā)揮。21d HBCD的短期暴露還可以引起大鼠的活動(dòng)性能增加，極低劑量(10μg/kg)的暴露還可能引起大鼠的焦慮和緊張心理，但是這些作用隨著大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育逐漸減弱。21d的HBCD暴露對(duì)大鼠神經(jīng)行為影響顯著。
　　 2、甲狀腺激素水平的變化

17、表明HBCD暴露可以促進(jìn)大鼠血清中甲狀腺激素水平。雖然甲狀腺激素在不同暴露時(shí)間、不同暴露劑量有差異，但是總的趨勢(shì)較為一致，TT3、TT4、FT3、FT4的含量升高，TSH的含量降低。其中，F(xiàn)T3、FT4的變化更為敏感，表明HBCD更容易通過(guò)影響FT3、FT4的水平對(duì)機(jī)體生理過(guò)程的產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示出暴露21d的甲狀腺激素變化較42d、90d更為顯著。甲狀腺激素水平的上升表明HBCD暴露引起了甲狀腺功能亢進(jìn)，可以解釋神經(jīng)行為結(jié)果中

18、HBCD暴露后大鼠神經(jīng)興奮、活動(dòng)性能增加等現(xiàn)象。
　　 3、TR信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程相關(guān)基因表達(dá)水平的變化表明甲狀腺激素干擾效應(yīng)及TR信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程可能是HBCD的神經(jīng)毒性效應(yīng)的內(nèi)在作用機(jī)制之一。3種不同構(gòu)型的TR基因表達(dá)主要是受甲狀腺激素T3控制的，HBCD暴露能夠引起TRα1和TRβ1 mRNA的表達(dá)上升，42d的TRα2表達(dá)水平下降，說(shuō)明HBCD可以通過(guò)改變TR基因表達(dá)干擾甲狀腺激素。
　　 21d的HBCD暴露可引起B(yǎng)TE

19、B基因表達(dá)顯著下降，BTEB是參與甲狀腺激素與TR結(jié)合的復(fù)合物與TRE的轉(zhuǎn)錄基因，受甲狀腺激素的調(diào)控，BTEB mRNA表達(dá)的變化也是甲狀腺激素受到HBCD干擾的結(jié)果。TR信號(hào)調(diào)控的下游神經(jīng)功能基因NGF在42d表達(dá)上升，作為神經(jīng)修復(fù)的重要因子，NGF表達(dá)上升可以提示神經(jīng)已經(jīng)受到損害。RC3在變更Ca2+/鈣調(diào)蛋白信號(hào)途徑、突觸可塑性的區(qū)域特異性損害和認(rèn)知功能衰減中起作用，42d RC3 mRNA表達(dá)降低，表明HBCD對(duì)腦具有神經(jīng)毒性效

20、應(yīng)。
　　 神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶相關(guān)的功能基因MAO-A受HBCD影響變化較小，而MAO-B的變化較為顯著，表明HBCD更能夠影響MAO-B的表達(dá)。而ChATmRNA的表達(dá)在21d暴露中表達(dá)下降而42d表達(dá)有升高趨勢(shì)。MAO和ChAT基因都與大腦認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)功能有關(guān)。HBCD對(duì)于甲狀腺激素及TR信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的干擾效應(yīng)，可以產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)，可能具有腦損害甚至可能導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育嚴(yán)重受損，產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶能力損傷、認(rèn)知障礙，引發(fā)

21、一些與神經(jīng)相關(guān)的疾病等。21和42d的HBCD暴露對(duì)于基因表達(dá)的影響更加突出。
　　 4、神經(jīng)遞質(zhì)含量與酶活性等生化指標(biāo)的變化表明HBCD暴露不僅在分子水平改變了神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)酶的表達(dá)，并在生化水平上也表現(xiàn)出神經(jīng)毒性效應(yīng)。單胺能系統(tǒng)中，暴露21d，HBCD主要通過(guò)促進(jìn)MAO活性抑制DA、NE、5-HT的含量對(duì)單胺能體系產(chǎn)生影響；而42d和90d，HBCD對(duì)MAO活性的影響較小，直接作用于神經(jīng)遞質(zhì)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是中樞神經(jīng)內(nèi)重要的信

22、息傳遞物質(zhì)，參與鎮(zhèn)痛、軀體運(yùn)動(dòng)、精神情緒活動(dòng)、睡眠、覺(jué)醒、應(yīng)激等多種生理過(guò)程，特別是對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑制起著協(xié)調(diào)作用。DA、NE、5-HT的含量變化可以解釋大鼠神經(jīng)行為中學(xué)習(xí)記憶能力提高、活動(dòng)性能增加、焦慮心理產(chǎn)生等現(xiàn)象。
　　 膽堿能系統(tǒng)中，HBCD主要通過(guò)降低ChAT活性并且促進(jìn)AchE活性控制Ach的含量，造成乙酰膽堿系統(tǒng)功能不足。Ach含量降低會(huì)引起學(xué)習(xí)記憶的障礙，同時(shí)也是阿爾茨海默病(AD)的重要成因。ChAT催