丙泊酚反復(fù)暴露對發(fā)育期大鼠學(xué)習(xí)記憶影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:丙泊酚是臨床較常用的靜脈麻醉藥，廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外臨床麻醉誘導(dǎo)及維持，ICU鎮(zhèn)靜和門診各種影像學(xué)檢查。因其具有起效快速、蘇醒迅速、用后惡心嘔吐、躁狂譫妄等副作用較小等優(yōu)點(diǎn)，也被廣泛應(yīng)由于新生兒和嬰幼兒的全身麻醉中。盡管其被廣泛使用，丙泊酚對于兒童的安全性及副作用的矛盾報(bào)道幾乎與其他全麻藥物一樣，均無全面詳盡的結(jié)論。有報(bào)道稱丙泊酚可激活GABA受體，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因?yàn)镚ABA介導(dǎo)的神經(jīng)元活性是哺乳動(dòng)物的腦發(fā)育的必需因素，

2、因此丙泊酚麻醉很可能干預(yù)未成熟神經(jīng)系統(tǒng)，從而產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶等功能障礙。MiRNA一類能時(shí)序調(diào)控發(fā)育進(jìn)程，長度約為20～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼蛋白的小分子RNA，其通過與靶基因mRNA互補(bǔ)配對來降解或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控靶基因表達(dá)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，miRNA的表達(dá)具有高度的保守性、組織特異性和時(shí)序性，是神經(jīng)發(fā)育過程中重要的調(diào)控因子。隨著對miRNA研究的深入，人們將研究視角逐漸轉(zhuǎn)移到其與全麻藥物的關(guān)系。已有實(shí)驗(yàn)表明，miR-132在

3、培育的海馬神經(jīng)元中存在較多，并且發(fā)揮著重要作用包括促進(jìn)神經(jīng)元生長，增強(qiáng)樹突棘長度等等。因此，本課題通過探討丙泊酚麻醉對神經(jīng)發(fā)育期大鼠的海馬神經(jīng)毒性、學(xué)習(xí)記憶能力和與miR-132的變化，進(jìn)一步提供丙泊酚麻醉對大鼠海馬影響的具體分子機(jī)制。
　　材料方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用體重13±3 g的7日齡的SD大鼠378只，清潔級(jí)，雌雄不拘。將大鼠隨機(jī)分為兩組(n=189只):脂肪乳組(Control組，C組)和丙泊酚組(Propofol組，P組)

4、。P組7日齡腹腔注射丙泊酚40 mg/kg，此時(shí)記為0min，再于第120min和第240min注射等量丙泊酚，連續(xù)3次;C組等時(shí)等量腹腔注入脂肪乳注射液（C組）。于末次注射后，各組立即隨機(jī)抽取5只，用動(dòng)脈血?dú)忉槒淖笮氖也蓜?dòng)脈血0.5 ml，進(jìn)行血?dú)夥治觥４溆啻笫笞匀惶K醒后，放回原籠。于21日齡斷母乳飼養(yǎng)。記末次腹腔注射(240 min)為0h。各組大鼠喂養(yǎng)至28日齡及60日齡時(shí)進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測試，即Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。末次造模

5、待大鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)、28 d及60 d水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩組大鼠水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射，取全腦制備石蠟切片，進(jìn)行Nissl染色分析、caspase-3免疫組化分析和分別利用MAP2和Spinophilin的雙重?zé)晒馊旧治龃笫蠛ｑR樹突棘變化情況。分別于末次注射后0h，4h，8h，16h，24 h，48 h及出生后第14d，28 d及60 d，大鼠水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射，麻醉后斷頭取海馬組織。利用real-tim

6、e qRT PCR方法，監(jiān)測各時(shí)間點(diǎn) miR-132和p250GAP mRNA變化情況;利用western blot探討miR-132對其靶基因p250GAP，及其下游肌動(dòng)蛋白Cdc42、Rac1和RhoA的調(diào)控作用;利用Western Blot蛋白檢測分析大鼠海馬樹突棘變化情況。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)大鼠（P組和C組）喂養(yǎng)至21d，稱重后，給予0.35g/kg水合氯醛腹腔注射暴露大鼠，待暴露成功后，參照大鼠腦圖譜，立體定位海馬位置，用微量注射器在

7、穿刺點(diǎn)緩慢注入5μ l Ad-miR-132腺病毒載體或Ad-vector空病毒載體(n=24只)。各組大鼠喂養(yǎng)至28日齡及60日齡時(shí)進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測試，即Morris水迷宮實(shí)驗(yàn);分別于微注射后第23d、28 d及60 d，水合氯醛麻醉后斷頭取海馬組織;于第28 d及60 d水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩組大鼠水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉后，取全腦制備石蠟切片。利用real-time qRT PCR方法，監(jiān)測各時(shí)間點(diǎn)miR-132和p

8、250GAP mRNA變化情況;利用western blot探討miR-132對其靶基因p250GAP，及其下游肌動(dòng)蛋白Cdc42、Rac1和RhoA的調(diào)控作用;利用MAP2和Spinophilin的雙重?zé)晒馊旧蚖estern Blot蛋白檢測分析大鼠海馬樹突棘變化情況;進(jìn)行Nissl染色分析、caspase-3免疫組化分析。
　　結(jié)果:1.丙泊酚暴露對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響:在出生后第28 d進(jìn)行的定位航行試驗(yàn)第2d至5d

9、，每天P組大鼠的逃逸潛伏期明顯多于C組(*p＜0.05)。而在生后第60 d定位航行實(shí)驗(yàn)中，第1至5d，每天P組大鼠的逃逸潛伏期明顯多于C組(*p＜0.05)。在第60 d進(jìn)行的空間探索實(shí)驗(yàn)中，與C相比，第28及第60日齡P組大鼠，均呈現(xiàn)出明顯的平臺(tái)象限所在時(shí)間縮短(*p＜0.05)。2.丙泊酚暴露后對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響:在第28 d和第60 d水迷宮實(shí)驗(yàn)后，P組（P組）神經(jīng)元所占百分比明顯低于各時(shí)間段C組（C組）(*p＜

10、0.05)。而在P組中，與第28 d水迷宮實(shí)驗(yàn)后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元所占比率相比，第60 d水迷宮實(shí)驗(yàn)后大鼠神經(jīng)元明顯降低(＃p＜0.05)。3.丙泊酚暴露后對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)的影響:P組在第28 d及第60 d水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，其海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(*p＜0.05)。對于P組，第60 d水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于其

11、在第28 d水迷宮實(shí)驗(yàn)后（＃p＜0.05）。4.Real-time qRT PCR檢測丙泊酚暴露后大鼠海馬組織中各時(shí)間點(diǎn)miR-132的變化:從大鼠出生后第1d起至第60 d，大鼠海馬區(qū)miR-132含量整體呈遞增趨勢，并且在第7d至第14d增長迅速，此外，從第14d起，海馬區(qū)miR-132含量基本維持較高水平且不再增長。與第1d相比，第10、14、21、28、35和第60 d大鼠海馬區(qū)miR-132含量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*p

12、＜0.05)。5.Real-timeqRT PCR檢測大鼠海馬組織中各時(shí)間點(diǎn)miR-132的變化:在C組中，與“0h”（第7d)相比，第14d、28 d和60 d時(shí)，海馬區(qū)miR-132的水平明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*p＜0.05)。對于P組，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與各自的C組相比，miR-132水平在第4h，8h，48 h和第14d，28 d，60 d有明顯的下降，而在第16h和第24 h呈現(xiàn)出明顯的增多（＃*＜0.05）。在P組中，與第0

13、h相比，大鼠海馬miR-132水平呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)變化(**p＜0.05)，即第4h，8h，48 h和第14d，28 d，60 d有明顯的下降，而在第16h和第24 h呈現(xiàn)出明顯的增多。6.Real-time qRT PCR檢測丙泊酚暴露后大鼠海馬組織中各時(shí)間點(diǎn)p250GAP mRNA表達(dá)的變化:在C組中，與“0h”(第7d)相比，第14d、28 d和60 d時(shí)，海馬區(qū)p250GAP mRNA的水平明顯下降(*p＜0.05)。在P組中，與

14、第0h相比，海馬區(qū)p250GAP mRNA的表達(dá)水平自第48 h后呈明顯增加的趨勢（＃p＜0.05）。對于P組，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與各自的C組相比，海馬區(qū)p250GAPmRNA的表達(dá)水平在自第24 h起有所增加(**p＜0.05)。7.Western Blot檢測丙泊酚暴露后大鼠海馬組織中各時(shí)間點(diǎn)p250GAP，Cdc42，Rac1和RhoA蛋白的表達(dá)情況:在C組中，與“0h”相比，我們發(fā)現(xiàn)大鼠海馬區(qū)p250GAP蛋白在第28 d呈現(xiàn)明顯的表

15、達(dá)下調(diào)(*p＜0.05)，在第28 d的Cdc42和Rac1蛋白表達(dá)卻呈現(xiàn)出明顯的表達(dá)增多(*p＜0.05)。在P組，與“0h”相比，我們發(fā)現(xiàn)大鼠海馬區(qū)p250GAP和RhoA蛋白在第28 d呈現(xiàn)明顯的表達(dá)上調(diào)(*p＜0.05)，而在第28 d的Cdc42和Rac1蛋白表達(dá)卻呈現(xiàn)出明顯的下降(*p＜0.05)。8.丙泊酚暴露引起大鼠海馬CA1區(qū)樹突棘的改變:Spinophilin在C組中表達(dá)強(qiáng)而多，而在P組中表達(dá)均明顯減弱(*p＜0.0

16、5)。與第28 dP組相比，第60dP組spinophilin表達(dá)進(jìn)一步降低（＃p＜0.05）;Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚暴露后大鼠海馬組織內(nèi)MAP2和spinophilin蛋白明顯的減低(*p＜0.05)。在P組內(nèi)，與第28 d相比，第60 d大鼠海馬組織內(nèi)MAP2和spinophilin蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（＃p＜0.05）。9.Real-time qRT PCR驗(yàn)證各組大鼠海馬內(nèi)微注射效果:與C組相比，P組和P+ Ad

17、-vector組，大鼠海馬內(nèi)miR-132表達(dá)降低(*p＜0.05);脂肪乳+miR-132過表達(dá)組(C+Ad-miR-132組)海馬內(nèi)miR-132表達(dá)增加(*p＜0.05)，說明過表達(dá)效果存在。與P組相比，丙泊酚+ miR-132過表達(dá)組(P+ Ad-miR-132組)海馬內(nèi)miR-132表達(dá)增多(＃p＜0.05）。10.Real-time qRT PCR檢測各組大鼠海馬微注射后其miR-132變化情況:與第28d C組相比，P組和

18、P+ Ad-vector組，第28d和第60d大鼠海馬內(nèi)miR-132表達(dá)均減低(*p＜0.05)。與第28d P組相比，第28d和第60dP+Ad-miR-132組海馬內(nèi)miR-132表達(dá)增多（＃p＜0.05）。11.Real-time qRT PCR檢測各組大鼠海馬微注射后其p250GAP mRNA變化情況:與C組相比，P組和P+ Ad-vector組，第28d和第60d大鼠海馬內(nèi)p250GAP mRNA表達(dá)均增加(p＜0.05)。

19、與第28d P組相比，第28d和第60d P+Ad-miR-132組海馬內(nèi)p250GAP mRNA表達(dá)降低（＃p＜0.05）。12.Western Blot檢測海馬內(nèi)微注射后各組大鼠海馬內(nèi)p250GAP，Cdc42，Rac1和RhoA蛋白的表達(dá)情況:與第28d C組相比，在P組和P+ Ad-vector組中，第28d和第60d大鼠海馬內(nèi)p250GAP和RhoA蛋白表達(dá)量均增加(*p＜0.05);而第28d和第60d大鼠海馬內(nèi)Cdc42和

20、Rac1蛋白表達(dá)量均降低(*p＜0.05)。13.海馬內(nèi)微注射及丙泊酚暴露對大鼠海馬CA1區(qū)樹突棘的影響:在第28 d時(shí)，與C組相比，P組和P+Ad-vector組中表達(dá)均明顯減弱(*p＜0.05);在第60 d時(shí)，與C組相比，P組和P+Ad-vector組中表達(dá)仍明顯減弱(＃p＜0.05);Western Blot結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，丙泊酚暴露大鼠后導(dǎo)致了其在第28 d和第60 d與C組相比，海馬組織內(nèi)MAP2和spinophilin蛋白明顯

21、的減低(*p＜0.05，＃p＜0.05)，P+ Ad-vector組表達(dá)也明顯減低(*p＜0.05，＃p＜0.05)。然而在P+Ad-miR-132組中，與第28dP組相比，MAP2和spinophilin在大鼠海馬區(qū)的蛋白含量均明顯增強(qiáng)(**p＜0.05);同樣，第60 d時(shí)與P組相比，其表達(dá)也明顯加強(qiáng)（＃＃p＜0.05）。14.海馬內(nèi)微注射及丙泊酚暴露對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響:在出生后第28 d進(jìn)行的定位航行試驗(yàn)第2d至5d，每

22、天P組和P+ Ad-vector組大鼠的逃逸潛伏期明顯長于C組(*p＜0.05;＃p＜0.05)。而第28d P+ Ad-miR-132組大鼠的逃逸潛伏期與P組相比，明顯改善(**p＜0.05)。在生后第60 d定位航行實(shí)驗(yàn)第1至5d，每天P組和P+ Ad-vector組大鼠的逃逸潛伏期均明顯多于C組(*p＜0.05;＃p＜0.05);而P+Ad-miR-132組大鼠的逃逸潛伏期與P組相比明顯縮短(**p＜0.05)。在第6d進(jìn)行的空間

23、探索實(shí)驗(yàn)中，與C組相比，第28及第60日齡P組和P+ Ad-vector組大鼠，均呈現(xiàn)出明顯的平臺(tái)象限所在時(shí)間縮短(*p＜0.05)。而P+Ad-miR-132組大鼠的平臺(tái)象限所在時(shí)間與P組相比明顯延長（＃p＜0.05）。15.海馬內(nèi)微注射及丙泊酚暴露后對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響:與28d C組相比，第28d P組、P+Ad-vector組和P+Ad-miR-132組，其海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的比率明顯降低(*p＜0.05);在第6

24、0d時(shí)，與C組相比，P組、P+ Ad-vector組和P+Ad-miR-132組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的比率明顯下降（＃p＜0.05）。16.海馬內(nèi)微注射及丙泊酚暴露后對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)的影響:與28d C組相比，第28d P組、P+Ad-vector組和P+Ad-miR-132組，其海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(*p＜0.05)。在第60d時(shí)，與C組相比，P組、P+ Ad-vec

25、tor組和P+Ad-miR-132組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)明顯增多（＃p＜0.05）。
　　結(jié)論:1.新生7日齡大鼠連續(xù)接受3次40mg/kg腹腔注射丙泊酚后其近遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)記憶能力有所改變，具體體現(xiàn)在:空間學(xué)習(xí)的過程呈現(xiàn)出減慢的趨勢及一定的記憶能力的損害。2、新生大鼠接受丙泊酚暴露后可導(dǎo)致其海馬神經(jīng)元樹突棘數(shù)目的改變，主要通過降低海馬miR-132含量，進(jìn)而增強(qiáng)靶基因p250GAP的水解能力，從而減少