天然藥物分析章hplc

1、1,,高效液相色譜法具有應用范圍廣的優(yōu)點，表現(xiàn)在：（1）HPLC不受試樣揮發(fā)性和相對分子質(zhì)量的限制，可用于分離高沸點、相對分子量大、熱穩(wěn)定性差的有機化合物，還可用于各種離子的分離；（2）HPLC不僅可利用被分離組分的極性差別，還可利用組分分子尺寸大小的差別、離子交換能力的差別以及生物分子間親和力的差別進行分離。它還可以用多種溶劑作為流動相，對于性質(zhì)和結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，分離的可能性比氣相色譜法更大；（3）HPLC易于收集流出物組分，可

2、利用制備柱進行較大量的制備。,2,第一節(jié) 高效液相色譜的技術參數(shù),一．速率理論 圖6-1是氣相色譜法和高效液相色譜法的H-µ曲線。由圖可見，兩者形狀明顯不同。HPLC法接近一條直線，而氣相色譜法曲線中有一極小值。,圖 6-1 GC和HPLC的典型H-μ曲線,3,,在HPLC中，由于流動相是液相，影響柱效的因素與GC不完全相同。因此，范第姆特方程（H = A + B/ µ + C µ

3、 ）應作修正。 在范第姆特方程中，HPLC與GC的渦流擴散項完全相同。 HPLC的分子擴散項是因同種組分分子由濃度大的譜帶中心向濃度較低的兩邊擴散所引起。它與組分分子的流動相中的擴散系數(shù)（Dm）成正比，與流動相的平均線速（µ）成反比。,,由于液相中擴散系數(shù)要比氣相中小4~5個數(shù)量級，HPLC中該相對于譜帶擴張的影響可以忽略不計。,4,,HPLC的傳質(zhì)阻力是由組分在兩相間的傳質(zhì)過程實際上不能瞬間達到

4、平衡而引起的，其傳質(zhì)阻力相包括三項：固定相傳質(zhì)阻力（Hs），移動流動相傳質(zhì)阻力（Hm）和滯留流動相傳質(zhì)阻力（Hsm），即:,,5,,氣相色譜法主要考慮固定相的傳質(zhì)阻力；液相色譜法與之不同，在整個傳質(zhì)過程中起主要作用的是流動相傳質(zhì)阻力，特別是滯留流動相的傳質(zhì)阻力，因此，改進固定相結(jié)構(gòu)，減小滯留流動相傳質(zhì)阻力是提高液相色譜柱效的關鍵。 以上各項可歸納為：,其中CdDm/u相實際上可以略去。于是，上式可簡寫為：,,6,,要想提高液相色

5、譜法的柱效，必須用小而均勻的固定相顆粒且要填充均勻，以減小渦流擴散和流動相傳質(zhì)阻力。 改進固定相的結(jié)構(gòu)，對于減小滯留流動相傳質(zhì)阻力以及固定相傳質(zhì)阻力至關重要。 此外，選用低黏度的流動相（如甲醇、乙腈等），也有利于減小傳質(zhì)阻力，提高柱效。,7,二．柱外效應,柱外效應（ extra column effect）是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，又稱柱外展寬。它分為柱前和柱后兩種。1．柱前展寬 主要由進樣引起。HPLC

6、進樣常采用兩種方式：閥門進樣，試樣由流動相帶入柱內(nèi)，進樣閥有死體積，會引起峰的展寬；注射進樣，將試樣注入液流中，或注入填料頂端，進樣器內(nèi)的死體積和進樣時液體擾動而引起的擴散，均會引起峰的展寬。 減小進樣閥的死體積，或者將試樣直接注射到填料頂端中心點或中心點以內(nèi)1~2mm處，可減少柱前的擴散，使柱效顯著提高。,8,2．柱后展寬,是由接管和檢測器流通池以及檢測器響應時間等因素引起。流動相在接管中心流速較大，而管壁附近流速較慢，管中心

7、處組分比管壁部分先到達檢測器，引起峰的展寬。因此盡可能用短的接管，減少流通池體積，可以提高柱效。 檢測器、放大器和記錄儀響應較慢，也會使描繪的色譜峰寬增加，峰高降低，對于保留值較小的組分影響尤為突出。所以，改進檢測器和記錄系統(tǒng)的響應速度也是克服柱后展寬的一個途徑。,9,三．分離度,色譜法的關鍵問題之一，就是難分離組分的分離問題。前已提出，有效塔板數(shù)（neff），是評價柱效應的一項指標，相對保留值（ris）是衡量色譜柱選擇性的另一

8、項指標。但這兩項指標未能說明難分離組分的真實分離效果。 氣相色譜的分離效果可直接表現(xiàn)在色譜的峰間距離和峰寬上，只有相鄰兩個色譜峰的距離較大、峰寬較窄時，兩個組分才能得到良好的分離。 綜合考慮保留值的差值與峰寬對柱效率的影響，常用分離度作為色譜柱的總分離效能指標，以判斷難分離物質(zhì)對在色譜柱中的分離情況。,10,,分離度用R表示，其定義為：相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰寬平均值之比值，即：,11,,R越大，兩色譜峰距離越

9、遠，分離效果越好。R < 1時兩峰有部分重疊；R =1，兩峰有98%的分離；R =1.5時，分離程度可達99.7%。當R =1.5時，為相鄰兩峰完全分離標志。 為了找出影響分離度的主要因素，可由式（6-8），推導出總分離效能方程式，即： （6-9） 式中， ：柱效相； ：

10、柱選擇相； 容量因子相。,12,13,如何提高分離度,1. 通過下列方法增加保留時間（1）選擇合適的分離參數(shù)（2）增加色譜柱長度（3）增加固定相濃度2. 通過下列方法降低譜帶寬度（1）使用均一的載體 （2）仔細填充色譜柱（3）選擇粒度小載體 （4）優(yōu)化流速（5）減少進樣量（6）降低系統(tǒng)死體積（7）降低輸出回路響應時間,14,四．系統(tǒng)適應性試驗,（1）色譜柱的理論塔板數(shù)n：按n = 5.54（tR

11、/W1/2）2 計算色譜柱的理論塔板數(shù) （2）分離度R：定量分析時，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標峰之間有較好的分離度，一般R≥1.5。（3）重復性：取各品種項下的對照溶液，連續(xù)進樣5次，峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0％（4）拖尾因子T：拖尾因子計算公式 T=W0.05h/2d1 T應在0.95~1.05之間。,15,第二節(jié) 高效液相色譜的實驗技術,,高效液相色譜,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

12、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,進樣口,檢測器,色譜圖,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,色譜柱,溶劑,泵,混合器,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

13、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,16,,一．色譜系統(tǒng) 1. 高壓泵 高壓泵是輸液系統(tǒng)最重要的部件。 理想的泵應當是：（1）輸出流量恒定，無脈動，且有較大的可調(diào)范圍；（2）輸出壓力高而且平穩(wěn)；（3）死體積小，便于迅速更換溶劑和采用梯度洗脫；（4）耐腐蝕，保養(yǎng)維修簡便，壽命長。,17,2. 梯度洗脫裝置,HPLC有等度洗脫和梯度洗脫兩種洗脫方式：前者保持流動相組成配比不變；后者則在洗脫過程中連續(xù)或階段

14、的改變流動相組成，它需要配有梯度洗脫裝置。梯度洗脫裝置有兩類：（1）低壓梯度，又稱外梯度。先混合后加壓，即按一定程序在常壓下預先將溶劑混合后，再用泵加壓輸入色譜柱。其優(yōu)點是只需一臺泵，價廉。（2）高壓梯度，又稱內(nèi)梯度。先加壓，后混合，即用幾臺泵分別將不同溶劑加壓，按程序規(guī)定的流量比例輸入混合室混合，再使之進入色譜柱。其優(yōu)點是方便，能得到任意類型的梯度曲線，易于自動化；但至少需兩臺泵，價格較高。,18,4. 色譜柱,色譜柱是HPLC最

15、重要的部件，由柱管和固定相構(gòu)成。它的作用是分離。HPLC的色譜柱管通常為內(nèi)壁拋光的不銹鋼管，形狀幾乎全為直形。近年來由于微粒填料和高壓勻漿裝柱技術的應用，大大提高了柱效。所用色譜柱都比較短（5~30cm），柱內(nèi)徑根據(jù)需要而異；一般分析柱，內(nèi)徑4~5mm：凝膠色譜柱，內(nèi)徑3~12mm；制備柱內(nèi)徑較大，可達25mm以上。,19,5. 檢測器,（1）紫外-可見光檢測器 有固定波長型和可調(diào)波長型兩類 。紫外檢測器靈敏度較高，但要

16、求試樣必須有紫外吸收，而且溶劑必須能透過所選波長的光，選擇的波長不能低于溶劑的最低使用波長。,20,紫外－可見檢測器,,I0 = 入射光強度,I = 透射光強度,A = 吸光度,a = 摩爾吸光系數(shù),b = 檢測池長度,c = 溶質(zhì)濃度,,I,I,,,,,,,,,,,C,b,o,,Detector Cell,,,,,,Log = A = abc,21,（2）光電二極管陣列檢測器（DAD）,是80年代出現(xiàn)的一

17、種光學多通道的檢測器，在晶體硅上緊密排列一系列的光電二極管，二極管越多分辨率越高。一般是一個二極管對應的接受光譜上一個納米譜帶寬的單色光。 二極管陣列檢測器的工作原理是復光通過流動池時，被組分選擇性的吸收，再進入單色器，照射在二極管陣列裝置上，使每個納米波長的光強變成相應的電信號強度，通過計算機的處理，從而獲得三維光譜—色譜圖。吸收光譜用于組分的定性，色譜峰用于定量，在中藥成分的研究中有廣泛的應用。,22,定性分析--峰純度檢驗

18、,23,,（3）示差折光率檢測器（differential refractive index detector） 利用流動相中出現(xiàn)試樣組分時引起折光率的變化進行檢測的。 示差折光率檢測器是通用型的，可對所有溶質(zhì)都響應，其缺點是不能用于梯度洗脫，且靈敏度較低。由于折光率隨溫度變化，示差折光率檢測器必須控制恒溫，一般用于無紫外吸收物質(zhì)分析。,24,,（4）熒光檢測器 主要特點是高靈敏度，高選擇性，樣品用量少。但相當多的物質(zhì)不產(chǎn)

19、生熒光，其應用受到一定限制。（5）電化學檢測器（electrochemical detector） 電極活性組分流進檢測器即發(fā)生電解，產(chǎn)生的電流經(jīng)放大而被檢測。非電極活性物質(zhì)不干擾測定，因而選擇性很高。檢出限達pg級。 （6）電導檢測器（conductivity detector） 是離子色譜法應用最多的檢測器。 對于分子不響應，對于離子則是通用型的。電導檢測器要求溫度恒定，需放在恒溫箱中

20、。雙示差電導檢測器消除了溫度變化的影響，可測定10-9mol/L的陰離子，也可編程控制溫度。,25,,（7）蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light-scatter detector， ELSD） 是90年代的通用型檢測器，對各種物質(zhì)幾乎同時響應，利用在一定的條件下粒子的數(shù)量不變，光散射強度正比于由溶質(zhì)決定的粒子的大小而進行測量的。這就是：樣品結(jié)構(gòu)不需要具備紫外發(fā)色團和合適的折射率，對梯度洗脫和流動相系統(tǒng)溫度變化不敏

21、感；對各種物質(zhì)的響應因子很近；在一次的分析中可以同時檢測主要成分和雜質(zhì)等。,26,,其工作原理是：將色譜柱流出液引入霧化器與通入的氣體混合形成均勻的微小液滴，經(jīng)過加熱的漂移管，蒸發(fā)除去流動相，而樣品組分形成氣溶膠，然后進入檢測器。用強光或激光照射氣溶膠，產(chǎn)生光散射，用光電二極管檢測散射光。 但是，其靈敏度比較低，尤其低于有紫外吸收的組分；此外，流動相必須是揮發(fā)性的，不能含有緩沖鹽類。,27,28,檢測器使用統(tǒng)計,29,二．色譜分離

22、方式,（一） 吸附色譜法1．原理 吸附色譜法（absorption chromatography）又稱液固色譜法（liquid-solid chromatography，LSC），它以固定吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力。試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，它將與流動相中的溶劑分子（S）在吸附劑表面發(fā)生競爭吸附。 達到平衡時，有 式中，K：吸附平衡常數(shù)

23、。 K大的強極性組分易被吸附，保留值大，難于洗脫；K小的弱極性組分難被吸附，保留值小，易于洗脫。因此，試樣中的各組分被分離。,,,30,2．固定相,吸附色譜法用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，以硅膠最為常用。硅膠的優(yōu)點較多，如線型容量較高、機械性能較好、不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學反應等。 硅膠的吸附活性是由于硅膠表面的硅醇基產(chǎn)生的。硅膠如吸附水，一部分硅醇基與水分子成氫鍵而失去活性，致使吸附力降低。升溫可以除去吸附

24、劑里的水，使硅膠活化。但是溫度不可過高，否則會使硅醇基脫去結(jié)構(gòu)水變成硅醚基，反而降低甚至失去吸附力。通常將硅膠在125~150℃干燥8~16h，干燥器中放冷后加入一定量的重蒸餾水調(diào)節(jié)活度，然后裝柱。,31,3．流動相,流動相的選擇是影響HPLC分離效果的主要因素。HPLC所用的流動相又稱為洗脫劑（eluant）。 吸附色譜法選擇流動相的原則是：極性大的試樣需用極性強的洗脫劑，極性弱的試樣應用極性較弱的洗脫劑。洗脫劑的極性可用Sny

25、der提出的溶劑極性參數(shù)Pˊ來表示。 實際工作中常用混合溶劑作為洗脫劑，以改善分離效果。 在分離復雜試樣時，可按一定程序連續(xù)的或階段的改變流動相的組成，這就是梯度洗脫（gradient elution）。它類似于氣相色譜法中程序升溫所起的作用，能夠提高分離效率，改善峰形，加快分析速度。,32,,流動相的優(yōu)化優(yōu)化：指在合理的時間內(nèi)，所有的流動相能使樣品各組分達到足夠的分離?！斑x擇合適強度的溶劑是獲得分離最佳化的首要

26、條件。”,33,,選擇流動相還要注意以下要求，這些要求也適用于其它類型的HPLC： （1）不允許使用能引起柱損失或柱保留特性變化的溶劑。如吸附色譜的流動相不應含水，使用硅膠做填料的色譜柱不能使用堿性溶劑。（2）溶劑純度要高。使用前應過濾，除去塵埃微粒，以免堵塞，還應除去溶解的氣體（稱為脫氣），以免在柱中或檢測器中產(chǎn)生氣泡而影響分離和檢測。 脫氣方式,34,,（3）溶劑對于試樣要有適量的溶解度，以免試樣在柱中沉淀而造成堵塞

27、。更換流動相時必須保證互溶。（4）流動相應與檢測器匹配。如用紫外檢測器時，流動相本身在檢測波長處應當無吸收。 溶劑的截止波長 （5）盡量使用低粘度溶劑，如甲醇、乙腈等可以提高柱效，還能降低色譜柱的阻力。,35,,36,（二）分配色譜法,1．原理分配色譜法（partition chromatography）又稱液液色譜法（liquid-liquid chromatography，LLC），是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶（或部分互

28、溶）的液體中溶解度的不同，有不同的分配，從而實現(xiàn)分離的方法。分配系數(shù)較大的組分，保留值也較大。,37,,根據(jù)固定相和流動相之間的相對極性的大小，可將分配色譜法分為兩類：（1）流動相極性低而固定相極性高的，稱為正相分配色譜法（normal phase partition chromatography）。它對于極性強的組分有較大的保留值，常用于分離強極性化合物。（2）流動相極性大于固定相的，稱為反相分配色譜法（reversed phas

29、e partition chromatography）。它對于極性弱的組分有較大的保留值，適于分離弱極性的化合物。,38,2．固定相,化學鍵合相（chemically bonded phase）是利用化學反應將有機分子鍵合到載體表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的。一般用硅膠作載體，采用的鍵合反應有酯化鍵合（Si-O-C型）、硅烷化鍵合（Si-O-Si-C型）和硅氮鍵合（Si-N型）等。其中，以硅烷化鍵合反應最為常用,39,,化

30、學鍵合相具有以下特點：（1）固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高。（2）能耐各種溶劑，可用于梯度洗脫。（3）表面較為均一，沒有液坑，傳質(zhì)快，柱效高。（4）能鍵合不同基團以改變其選擇性，例如鍵合氰基、氨基等極性基團用于正相色譜法，鍵合離子交換基團用于離子色譜法等。 因此，它是HPLC較為理想的固定相。,40,,根據(jù)鍵合固定相與流動相相對極性的強弱，可將鍵合相色譜法分為正相鍵合相色譜法和反相鍵合相色譜法。（1）在正相鍵合相色譜

31、法中，鍵合固定相的極性大于流動相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強極性化合物。 （2）在反相鍵合相色譜法中，鍵合固定相的極性小于流動相的極性，適用于分離非極性、極性或離子型化合物，其應用范圍比正相鍵合相色譜法更廣泛。據(jù)統(tǒng)計在高效液相色譜法中，約70%~80%的分析任務是由反相鍵合相色譜法來完成的。,41,3. 流動相,分配色譜法所用流動相的極性必須與固定相顯著不同。選擇流動相一般靠實驗?？梢杂脝我坏娜軇?，更常用混合溶劑。正相色

32、譜法常用低極性溶劑如烴類，加入適量極性溶劑如氯仿、醇類以調(diào)節(jié)溶劑極性參數(shù) P’，其溶劑系統(tǒng)的選擇與吸附色譜法相同。反相色譜法中，溶劑的洗脫能力用溶劑強度因子( )表示，其大小順序與正相色譜的P’相反，通常以水或無機鹽緩沖溶液為主體，加入甲醇、乙腈等調(diào)節(jié)極性。 梯度洗脫時，正相色譜法通常逐漸增大洗脫劑中極性溶劑的比例；而反相色譜法則與之相反，逐漸增大極性相對較低的甲醇或乙腈的比例。,,42,4. 反相離子對色譜法,離子對色譜

33、法（ion pair chromatography）是20世紀70年代中期發(fā)展起來的。其中，反相離子對色譜法應用較多，它是在強極性的流動相中加入與被測離子電荷相反的平衡離子，從而實現(xiàn)色譜分離的。常用的平衡離子試劑有烷基磺酸鈉和季銨鹽兩類，前者適用于分離有機堿類和有機陽離子，后者適用于分離有機酸類和有機陰離子。,43,（三）離子色譜法,離子色譜法（ion chromatography，IC）是由經(jīng)典離子交換色譜法（ion exchange

34、 chromatography，IEC）派生出來的。它們都是用能交換離子的材料（例如離子交換樹脂）作為固定相，利用它與流動相中試樣離子進行可逆的離子交換來分離離子型化合物的方法。 1．離子交換原理 試樣中的離子與離子交換樹脂上的離子發(fā)生交換反應,44,2．離子交換色譜法的固定相和流動相,HPLC常用的離子交換填料有以下幾種：（1）多孔樹脂：直徑為10~20µm。其交換容量較高，但有溶脹性，不耐高壓，而且表面微孔結(jié)構(gòu)

35、影響傳質(zhì)，柱效較低。（2）薄層樹脂：即在30~40µm直徑的玻珠表面涂一層離子交換樹脂。其柱效較高，耐壓，但交換容量低。（3）離子性鍵合固定相：在硅膠基體表面鍵合離子交換基團而成，制成5或10µm直徑的全多孔微粒。它的機械性強度較高，化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較好，柱效高，交換容量能符合要求，較為理想。,45,,離子交換色譜法大多用一定的pH和一定濃度的緩沖液作為洗脫劑。分離有機酸堿時，洗脫劑的pH影響酸堿的解離程

36、度，因而影響k。最好將pH選擇在被分離的酸堿的pKa附近。緩沖液的離子強度也會影響k。一般來說，離子強度增大，即緩沖溶液濃度增大時，k減小。對于多組分混合物的分離，可以采取改變離子強度或改變緩沖液pH兩種梯度洗脫方式。,46,3. 電導檢測雙柱離子色譜法,離子交換色譜法現(xiàn)代化過程中遇到的一個難題是離子的檢測。使用紫外、熒光等檢測器只能分析某些具有特殊性質(zhì)的離子。利用電導檢測器檢測離子具有通用性和靈敏度高的優(yōu)點，但因洗脫劑中的離子也有

37、響應而難以使用。離子色譜法的發(fā)明解決了這個難題，開創(chuàng)了分離分析離子化合物的新局面。 雙柱離子色譜法又稱抑制型離子色譜法。該法在分離柱和電導檢測器之間增加了一根抑制柱（suppressor column），柱中填充電荷與分離柱相反的離子交換樹脂。洗出液（eluate），即分離柱流出的溶液，進入抑制柱發(fā)生抑制反應，除去洗脫劑離子，然后就入檢測器。（1）陰離子分析 （2）陽離子分析,47,4．電導檢測單柱離子色譜

38、法,電導檢測單柱離子色譜法又稱非抑制型離子色譜法。它只用一根分離柱，不用抑制柱。由于減少了抑制柱帶來的死體積，分離效率高，且能用普通的HPLC儀改裝。該方法近年來發(fā)展更為迅速。 單柱離子色譜法的基本原理是：（1）采用了低濃度洗脫劑，降低洗出液的本底電導水平。（2）采用了低容量的離子交換樹脂，使保留值保持不變。,48,,離子色譜法具有靈敏度高、選擇性好、快速、能同時分析多種離子的優(yōu)點，特別是對于陰離子的分離分析，在各種儀器分析

39、方法中堪稱首選方法。在檢測手段方面，除電導檢測器以外，還可用柱后衍生技術，使用其他類型的檢測器。為了防止微量金屬離子的干擾，專用的離子色譜儀通常采用全塑結(jié)構(gòu)。 屬于離子色譜法的還有離子排斥色譜法（ICE）和流動相離子色譜法（MPIC）等，可參閱有關專著。,49,（四）尺寸排阻色譜法,1．原理 尺寸排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC），又稱凝膠色譜法、凝膠過濾色譜法（gel f

40、iltration chromatography，GFC）、凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）、空間排阻色譜法 它主要用于較大分子的分離。固定相為化學惰性多孔物質(zhì)— 凝膠，它不具有吸附、分配和離子交換作用。凝膠的孔徑與被分離組分分子大小相應，當試樣中大小不同的組分分子隨流動相經(jīng)過凝膠顆粒時，它們滲入凝膠微孔的程度不同；大分子受排阻不能進入微孔，分子越小則進入微孔越深，因而滯留時間

41、不同。試樣中的各組分按照分子大小順序洗脫,50,,,51,2．固定相和流動相,凝膠種類很多，按強度分軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)凝膠3類：（1）軟質(zhì)凝膠，如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠，它們適用于水作流動相，具有較大的溶脹性，只能在常壓下使用。（2）半硬質(zhì)膠，如交聯(lián)聚苯乙烯，它們比軟質(zhì)膠稍耐壓，是親油性的，宜用有機溶劑作流動相。（3）硬質(zhì)膠，如多孔硅膠，多孔玻璃等，它們可在較高壓強和較高流速下操作。但是，由于凝膠孔徑對于分離至關重要，用硬質(zhì)膠時仍

42、應注意壓強不宜過高（<7Mpa），流速不宜過快（<1ml/min），而且只能緩緩增加，否則會影響凝膠孔徑和分離效果。,52,（五）親和色譜法,1．原理 親和色譜法（affinity chromatography）是利用生物分子親和力進行色譜分離的技術。生物中許多大分子化合物具有一種特性，能與結(jié)構(gòu)對應的某種專一分子可逆地結(jié)合。例如酶與底物；抗原與抗體；激素與受體；RNA與和它互補的DNA等。生物分子間的這種結(jié)合力稱為親

43、和力。,53,,該方法將可親和的一對分子的一方，即配基，通過間隔基手臂以共價鍵結(jié)合到載體上作為固定相；而另一方面，即親和物則在試樣中。當含有親和物的復雜混合試樣隨流動相流經(jīng)固定相時，親和物就與配基結(jié)合而與其他組分分離。在其它組分洗脫之后，改變條件以降低親和物與配基的親和力，或使間隔基手臂斷裂，就能使被分離的物質(zhì)洗脫下來。 親和色譜法特別適用于生物化學，可用于各種酶、輔酶、激素和免疫球蛋白等生物分子的分離。,54,圖 6-10

44、親和色譜法示意圖,55,2．固定相,親和色譜法的固定相又稱親和吸附劑，由載體和配基（L）構(gòu)成。載體要求：（1）具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，易為大分子滲透。（2）具有相當數(shù)量可供偶聯(lián)的集團，能結(jié)合配基。（3）沒有吸附性，不發(fā)生非專一吸附。（4）均一，有一定硬度，性質(zhì)穩(wěn)定，親水等。應用最多的載體是瓊脂糖凝膠，商品名Sepharose或Bio-Gel A。瓊脂糖凝膠在pH4~9穩(wěn)定，通過交聯(lián)劑處理的凝膠適用范圍可擴大到pH3~12。其他常用的

45、載體還有聚丙烯酰胺載體、葡聚糖凝膠、多孔玻璃等。,56,3．吸附與洗脫,親和色譜法的一般操作方法是：將親和吸附劑裝柱，用緩沖溶液平衡色譜柱，再將待分離的溶液過柱。為使親和物（X）能緊密結(jié)合在配基上，應選擇適當pH、離子強度和化學組成一定的平衡緩沖液，并控制適當溫度。試樣上柱后，可用平衡緩沖液或較高離子強度的溶液淋洗，以除去非專一吸附的雜質(zhì)。然后，進行親和物的洗脫。,57,第三節(jié) 高效液相色譜的分析應用,一．樣品預處理和色譜柱保護 （

46、一）分析前樣品的處理 1．柱污染來源2．樣品預處理的方法 通常原則是處理的樣品極性范圍越窄越好，當然要保證待測組分的最大回收。 ODS反相柱，要求最大程度去掉k’值大的脂溶性雜質(zhì)； 硅膠柱要最大程度去掉極性大即與硅膠吸附大的雜質(zhì)。,58,HPLC法測定延胡索中叔胺類生物堿的含量,主要生物堿有d-紫堇堿（d-corydaline，即延胡索甲素）、dl-四氫巴馬亭（dl-tetrahydropalmatine，即延胡索乙素）

47、、原鴉片堿（protopine，即延胡索丙素）、l-四氫黃連堿（l-tetrahydrocoptisine，即延胡索丁素）、dl-四氫黃連堿（即延胡索戊素）、l-四氫非洲防已堿（l-tetrahydrocolumnamine，即延胡索己素）、延胡索辛素（corydalis H）、延胡索壬素（corydalis I）、延胡索癸素（corydalis J）、延胡索子素（corydalis K）、延胡索丑素（corydalis L）、α-別隱

48、品堿（α-allocryptopine，即延胡索寅素）、紫堇鱗莖堿（corybulbine，即延胡索庚素）、去氫紫堇堿（dehydrocorydaline，即延胡索甲素）、紫堇單酚堿（延胡索胺堿，corydalmine）、去氫延胡索胺（dehydrocorydalmine）、非洲防已堿（columbamine）、巴馬亭（palmatine）等。,59,,樣品制備：取藥材粉末用少量10%氨水潤濕，20min后用苯冷浸24h；取一定量苯提取

49、液，減壓蒸干，加1%醋酸溶解，離心或用0.45µm濾膜過濾，1%醋酸定容作為樣品液。,60,,（1）過濾或離心方法：采用微孔濾膜、高速離心、超濾等方法，可方便快速清除不溶性物質(zhì)及大分子的植物蛋白、多糖、樹脂等雜質(zhì)。（2）溶劑提取方法：這是中藥樣品預處理中最常用的方法之一。如生物堿、有機酸、中性化合物，首選酸堿提取方法或利用離子對方法處理生物堿和有機酸。其次可選用適當強度的溶劑，以不同的方式提取（索氏、冷浸、滲濾、超聲等）精制

50、。,61,,（3）柱層析：選擇不同的吸附劑如氧化鋁、硅膠、硅藻土、聚酰胺、大孔樹脂、纖維素、Sephdex LH20等，用不同的洗脫液進行處理。該方法的特點是樣品回收率高且回收率值穩(wěn)定。缺點是操作麻煩。 通常情況下：中性氧化鋁填料適合處理生物堿、強心苷；硅藻土適合處理生物堿、有機酸、中性物質(zhì)；硅酸鎂適合脂溶性物質(zhì)；聚酰胺適于黃酮；大孔樹脂適于皂苷、多糖；纖維素適于多糖；Sephdex LH20適用于上述所有化合物按分子量大

51、小進行分級。以上凈化過程不外乎是保留欲測組分，洗脫除去干擾物質(zhì)。,62,,（4）固相萃?。汗滔嗵盍贤?，把填料做成商品小柱，使用極為方便。但成本相對較高。 使用中應遵循色譜基本原理，根據(jù)樣品的具體情況選擇合適的萃取柱和洗脫液。,63,（二）色譜柱的保護,（1）加保護柱 （2）凈化樣品（3）流動相應當過濾處理（4）防止柱中細菌生長（5）柱壓需比填充壓力?。?）防止柱子的震動和撞擊,64,溶劑過濾,不干凈的溶劑或在溶劑瓶中

52、長菌的溶劑會阻塞溶劑過濾器，降低泵的操作性能。遵從下列建議可以提高性能，延長溶劑過濾器的壽命：使用無菌溶劑瓶避免溶劑長菌。用濾膜過濾溶劑去除微生物。每兩天更換或過濾溶劑。避免溶劑瓶直接日照。,65,溶劑信息,避免使用下列對不銹鋼有腐蝕性的溶劑：鹵化物堿金屬溶液和相應的酸溶液。高濃度的無機酸例如：硝酸和硫酸。能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。含有過氧化物的色譜級醚必須用氧化鋁干燥劑。在有機溶

53、劑中的有機酸溶液。含有強絡合劑的溶液。四氯化碳和異丙醇或THF混合液。,66,正確的進樣方式,1.進樣量：要么小于定量環(huán)體積的一半，要么滿刻度進樣（需要推進3~5倍量進樣環(huán)體積的樣品，這樣進樣才準確。）2.進樣動作：在Load狀態(tài)推針，動作要平緩，以防樣品沖出，進樣后先切換到Inject狀態(tài)，再拔針，以防倒吸而產(chǎn)生氣泡。3.清洗：在Inject狀態(tài)下清洗。4.廢液管的出口末端應與進樣口水平，以防樣品倒流或產(chǎn)生虹吸。,67,

54、二．在中藥分析中的應用,1．應用概況 高效液相色譜法在中藥分析的日趨廣泛，已成為中藥質(zhì)量評價的最常規(guī)分析方法。 如在中藥質(zhì)量規(guī)范化評價中占有重要位置，它不僅可以鑒別中藥的真?zhèn)?，區(qū)別類同品，還可控制毒劇藥的微量成分限度；既可對已知有效成分的品種定性定量，又可對成分未明確或成分復雜的品種進行指征性成分分析。 在進行中藥材及中藥注射劑進行指紋圖譜分析時，應用最多的方法也是高效液相色譜法。進行中藥新藥研究，制定原料藥材和制劑質(zhì)量標準

55、時，一般首選的方法同樣是高效液相色譜法。,68,69,第四章 液相色譜分析技術 的新進展,一. 液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用 液相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用（LC—MS）集高效分離、多組分同時定性和定量為一體，是分析混合物最為有效的工具。特別適用于那些高極性、熱不穩(wěn)定性、高相對分析質(zhì)量和低揮發(fā)性的有機化合物。 液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術的研究開始于20世紀70年代，直到90年代才出現(xiàn)了被廣泛接受的商品

56、接口和配套的儀器。其質(zhì)量分析器主要有磁質(zhì)量分析器、四極桿質(zhì)量分析器和離子阱質(zhì)量分析器等。,70,LC/MS分析特點,定性，結(jié)構(gòu)信息，高檢出限檢測器擴展，增加可分析化合物類型，線性寬樣品前處理簡單，部分取代色譜分離適用的待測物范圍廣，極性、揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性、大分子,71,72,二．超臨界流體色譜法,超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatogrophy，SFC）是以超臨界流體作為流動相的一種色譜法。