第五章體內(nèi)藥物分析

1、第五章 體內(nèi)藥物分析,生物樣品特點(diǎn),1、被測(cè)定的藥物和代謝物的濃度低；2、樣品大多需要分離和凈化；3、樣品量少，連續(xù)測(cè)定時(shí)，很難再度獲得完全相同的樣品。4、工作量較大，5、要求很快地提供結(jié)果(毒物檢測(cè)),樣品制備：去除蛋白質(zhì)、綴合物水解、化學(xué)衍生化、分離濃集（液液萃取、固相萃取等）；樣品測(cè)定：光譜分析法、色譜分析法、免疫分析法、生物學(xué)方法方法驗(yàn)證：特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍、定量下限、精密度與準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、提取回收

2、率,體內(nèi)藥物分析：,第一節(jié)、常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏,一、體內(nèi)樣品的種類、采集與制備（一）血樣：血漿、血清血漿：選用最多。因血漿中的藥濃可反映藥物在體內(nèi)的狀況。而且血漿中藥物濃度的數(shù)據(jù)報(bào)道較多，可供借鑒。血漿是全血在加肝素、枸櫞酸、草酸鹽等抗凝劑的全血經(jīng)離心后分取，量約為全血的一半。,血漿的制備：采集的靜脈血液置含有抗凝劑的試管中，混合后，以2500?3000r/min離心5?10min使與血球分離，所得淡黃色上清液即為血漿。

3、 抗凝劑—最常用的是肝素（heparin），肝素是體內(nèi)正常成分，因此不會(huì)改變血樣的化學(xué)組成或引起藥物的變化，一般不會(huì)干擾藥物的測(cè)定。通常1ml血液需用肝素0.1?0.2mg或20IU(1mg?126IU)?？刹槐販?zhǔn)確控制 其它抗凝劑EDTA、枸櫞酸鹽、草酸鹽等，是與血液中的鈣離子結(jié)合的試劑，它們可能引起被測(cè)組分發(fā)生變化或干擾某些藥物的測(cè)定，不常使用。,血清的制備：采集的靜脈血液置試管中，于37℃或室溫放

4、置30min?1h。血液凝固后，用細(xì)竹棒或玻璃棒輕輕剝?nèi)ピ嚬鼙谏系难灒僭?500?3000 r/min離心5?10min，上層淡黃色液體即為血清。 現(xiàn)文獻(xiàn)所指血藥濃度為血漿或血清中藥物總濃度（游離的和血漿蛋白結(jié)合的總濃度）。,血漿與血清的區(qū)別,血清比血漿只是少一種纖維蛋白原 一般血漿中藥物濃度與血清中藥物濃度相當(dāng)血漿比血清的分離快，而且制取量約為全血的50%~60%（血清為全血的50%左右），多數(shù)用血漿進(jìn)行分析。若血漿中含

5、有的抗凝劑對(duì)藥物濃度測(cè)定有影響時(shí)，則應(yīng)使用血清樣品 。,（二）尿樣：尿樣測(cè)定主要用于藥物劑量回收研究、藥物腎清除率和生物利用度等研究，以及測(cè)定代謝物類型等。體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型（母體藥物）或代謝物及其綴合物形式排出。尿樣常需加入防腐劑。,成人一日排尿量為1?5L。尿樣包括隨時(shí)尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時(shí)間尿幾種。因尿液濃度變化較大，所以應(yīng)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)排入尿中的藥物總量。一般采集時(shí)間尿（規(guī)定時(shí)間內(nèi)采集尿液體積和

6、排入尿中的藥物總量）。 尿液中藥物濃度的改變不能直接反映血藥濃度，即與血藥濃度相關(guān)性較差、尿液量較大不易保存等。,（三）、唾液： 唾液中的藥物濃度通常與血漿濃度相關(guān)。樣品易得，取樣無損害，尤易為兒童接收。有些可從藥物唾液濃度推定血漿中游離藥物濃度。 唾液由腮腺、頜下腺和舌下腺三個(gè)主要的唾液腺分泌匯集而成前兩者分泌量占總量90%。兩者中濃度大致相當(dāng)。 取樣：在潄口后15min，安靜

7、狀態(tài)下采集口腔內(nèi)然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾) 。如口嚼石臘片或?qū)幟仕?、維生素C等置于舌尖，棄去初始部分后采集。刺激后采集的為混合唾液。,藥物在臟器組織中的分布情況，常用胃、肝、腎、肺、心等。制備：測(cè)定之前一般需制成勻漿組織樣品的處理：沉淀蛋白法、酸水解法、酶水解法 （蛋白水解酶）,（四）組織：,（五）頭發(fā)：,應(yīng)用— 體內(nèi)微量元素含量測(cè)定 — 用藥史的估計(jì) — 臨床用藥和藥物非法濫

8、用的區(qū)別 — 毒性藥物檢測(cè),頭發(fā)樣品的采集：采集枕部發(fā)樣(帶根部），微量元素在前額部位的頭發(fā)中含量最低，枕部含量最高。頭發(fā)樣品的洗滌：除去外源性污染物，推薦使用丙酮-水-丙酮；丙酮浸泡攪拌10min，自來水漂洗3次，再用丙酮浸泡攪拌，自來水、蒸餾水各洗3次。頭發(fā)樣品的處理：直接甲醇提取、酸水解、堿水解、酶水解（葡萄糖醛酸酶）,三、體內(nèi)樣品的貯存與處理,（一）冷藏與冷凍血漿和血清需采集后及時(shí)分離，一般最遲不超過2h，分

9、離后再置冰箱或冷凍柜中保存（-20~-80℃）。尿樣應(yīng)立即測(cè)定，若收集24h的尿液不能立即測(cè)定時(shí)，可加入甲苯、氯仿、醋酸等防腐劑，一般可保存24~36h，也可加入疊氮化鈉較長時(shí)間保存。唾液在保存過程中會(huì)放出二氧化碳使pH值升高。另唾液中含有粘蛋白，須離心后冷藏或冷凍（二）去活性終止酶的活性方法：快速冷凍、微波照射、加入酶活性阻斷劑等。,分析方法與樣品處理步驟的選擇,第二節(jié)、體內(nèi)樣品的的前處理,一、體內(nèi)樣品預(yù)處理的目的 1、

10、使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放出來，以測(cè)定藥物的總濃度。 2、介質(zhì)復(fù)雜，干擾物多，待測(cè)物濃度低，須分離干擾物質(zhì)、富集待測(cè)藥毒物 3、為了適應(yīng)和符合測(cè)定方法所要求的靈敏度 4、為了防止分析儀器的污染、劣化，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度、精密度和選擇性等。,二、常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法要考慮：藥物的理化性質(zhì)（極性、酸堿性、光譜特性、揮發(fā)性、穩(wěn)定性），藥物測(cè)定的目的，選用的生物體液和組織的類型，待測(cè)物的濃度范圍，樣品制備與分析技術(shù)的關(guān)系。,

11、（一）、去除蛋白質(zhì),是測(cè)定血漿、血清、全血及組織勻漿等樣品中藥物時(shí)的最先處理步驟。1、加入可與水混溶的有機(jī)溶劑（體積比、pH值） 破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵。常加入乙腈、甲醇、乙醇等，能使與蛋白結(jié)合狀態(tài)的藥物釋放，將混合物超速離心，取上清液作為樣品。,2、加入中性鹽 使蛋白脫水而沉淀，硫酸銨最常用3、加入強(qiáng)酸 與蛋白形成沉淀，陰離子型沉淀劑。如三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸等，在酸性下分解的藥物不宜用本法去蛋白。

12、4、熱凝固法 加熱至90℃蛋白熱變性后離心或過濾除去,（二）分離、純化與濃集 當(dāng)藥物濃度較低或分析方法的特異性或靈敏度不夠高時(shí)，生物樣品需分離、純化與濃集。,1、液相萃取法,溶劑選擇—合適的溶劑是成功的主要條件 ①了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其性質(zhì) ②對(duì)藥物未電離分子可溶，對(duì)電離形式分子不溶 ③沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，毒性小與水不相混溶 ④不影響紫外檢測(cè) ⑤具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性 ⑥不易乳化,23,提取

13、溶劑：極性相似相溶溶劑的用量：一般有機(jī)相與水相之比為1：1~5：1溶液的pH調(diào)節(jié)：最佳pH選擇主要與藥物的pKa值有關(guān)。酸性藥物pH應(yīng)低于藥物pKa值1~2個(gè)單位；堿性藥物：pH應(yīng)高于藥物pKa值1~2個(gè)單位。提?。哼M(jìn)行一次（至多二次）提取，濃集：常用吹氮?dú)馐谷軇]散，或減壓蒸發(fā)（注意暴沸）。,生物樣品宜在堿性或近中性提取，生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)多為酸性，在堿性下不易被萃取出來。,,空白血清在pH2、pH7和pH13三種緩沖液中用

14、乙醚提取，提取液HPLC(220nm)測(cè)定，在pH13下提取液中雜質(zhì)峰最少。,液液萃取特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可將大部分內(nèi)源性雜質(zhì)去除；經(jīng)濟(jì)實(shí)用、可使樣品富集、可一次進(jìn)行多個(gè)樣品萃取 缺點(diǎn)：乳化、污染環(huán)境、 乳化的去除：加少量固體氯化鈉到水相中可減輕乳化；輕微乳化離心；嚴(yán)重乳化低溫冰箱快速冷凍破壞乳化層后融化離心。,2、固相萃取法：,以固相分離方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，從水相中分離出所需測(cè)定的組份，通常以柱分離方式進(jìn)行操作，故有時(shí)這種

15、方法又稱為固相提取 活化?上樣?淋洗?洗脫 洗脫液濃集,28,固相萃取的模式及原理,,反相固相萃取正相固相萃取離子交換固相萃取,,① 陰離子交換② 陽離子交換,實(shí)驗(yàn)步驟,第一步：用甲醇潤濕小柱，活化填料 第二步：用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱 —除去大部分甲醇 第三步：加樣，使樣品經(jīng)過小柱，棄去廢液 第四步：用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱，去除內(nèi)源性雜質(zhì)

16、 第五步：選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇┫疵摫环治鑫?，收集洗脫液，揮干溶劑，備用或直接進(jìn)行在線分析 血漿樣品可直接上柱，樣品量0.1~2ml，流速1~2ml/min,31,本法特點(diǎn)：少溶劑、少污染、減少液液萃取的乳化。適合各種液體檢材如血、尿、洗胃液、現(xiàn)場(chǎng)水、飲料等，對(duì)于肝、腎、胃以及其他固體檢材，均需制成水液方可進(jìn)行固相萃取。,柱切換高效液相色譜技術(shù)是指由閥來改變流動(dòng)相走向與流動(dòng)相系統(tǒng)，從而使洗脫液在一特定

17、時(shí)間內(nèi)從預(yù)處理柱進(jìn)入分析柱的技術(shù)。 用兩個(gè)或兩個(gè)以上柱子連接構(gòu)成色譜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，使不同柱子達(dá)到不同分離目標(biāo)，柱子間用切換閥聯(lián)結(jié)，這就是柱切換技術(shù)?；驹硎鞘紫仍陬A(yù)柱上實(shí)現(xiàn)生物體液中干擾大分子與待測(cè)藥物的分離，然后用柱切換將待測(cè)藥物從預(yù)柱轉(zhuǎn)移至分析柱上完成色譜分析。,自動(dòng)化固相萃取-柱切換高效液相色譜法,3. 超濾法,膜分離技術(shù)，可用于測(cè)定生物樣品中游離藥物濃度按照分子截留量的大小，可分離30?1000kD

18、的可溶性生物大分子物質(zhì)?？杉訅哼^濾或高速離心。,（三）、輟合物的水解：,酸水解法：強(qiáng)酸、加熱酶解：常用葡萄糖醛酸酶，一般控制pH4.5~5.5 ，37℃孵育數(shù)小時(shí)。溶劑解：,（四）、化學(xué)衍生化,1、使藥物變成能被分析的性質(zhì)2、提高檢測(cè)靈敏度3、增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性4、提高對(duì)光學(xué)異構(gòu)體分離的能力氣相色譜衍生化液相色譜衍生化,衍生化方法：柱前衍生， 柱后衍生,氣相色譜衍生化方法：硅烷化、?；⑼榛?、不對(duì)稱衍生化液相色譜衍生

19、化方法：紫外衍生化、熒光衍生化、電化學(xué)衍生化、手性衍生化,第三節(jié)、體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證,一、分析方法的建立（一）、分析方法的選擇1、色譜分析法2、免疫分析法3、生物學(xué)方法,常用分析方法的特點(diǎn),,放射免疫,0.001,（二）、分析方法建立的一般程序1、色譜條件的篩選：確定最佳分析檢測(cè)條件；色譜柱(型號(hào)、牌號(hào)、填料性質(zhì)、柱長度)；流動(dòng)相組分及配比、流速、柱溫、進(jìn)樣量、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度及其加入量等；使各物質(zhì)具有足夠的方法靈敏度(

20、LOQ)；良好的色譜參數(shù)(n、R、T)和適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間(tR)。,2、色譜條件的優(yōu)化：,在進(jìn)行分離條件篩選時(shí)，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對(duì)分離與檢測(cè)的干擾，步驟如下： 空白溶劑試驗(yàn) ——溶劑(方法特異性) 空白生物基質(zhì)試驗(yàn) —— 內(nèi)源性物質(zhì)干擾(方法特異性) 模擬生物樣品試驗(yàn) —— 方法驗(yàn)證（效能指標(biāo)） 3、實(shí)際生物樣品測(cè)試,二、分析方法的驗(yàn)證,1．特異性——避免干擾2．標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范

21、圍3．定量限——靈敏度4．精密度與準(zhǔn)確度——結(jié)果可重現(xiàn)5．樣品穩(wěn)定性 6．提取回收率7．分析過程的質(zhì)量控制,體外藥物分析,（一）、方法特異性(專屬性或選擇性),方法的特異性(specificity)——又稱專屬性或?qū)Ｒ恍?，通常與選擇性(selectivity)互用——系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時(shí)，方法準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的能力專屬性——表示所檢測(cè)的信號(hào)(響應(yīng))系屬于待測(cè)藥物

22、所特有的選擇性——系指將待測(cè)物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力,考察一個(gè)分析方法是否具有特異性，應(yīng)著重考慮以下幾點(diǎn)：1. 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾比較——待測(cè)藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測(cè)信號(hào)；2. 代謝產(chǎn)物的干擾比較——模擬生物樣品和用藥后的實(shí)際生物樣品的檢測(cè)信號(hào)；3. 伍用藥物的干擾還要考慮患者可能同時(shí)服用藥物(通常為數(shù)有限)的干擾。提供三張色譜圖，空白生物樣品圖、空白加對(duì)照、實(shí)際生物樣品圖；4.與參比方法的相關(guān)性,（二）

23、、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍,標(biāo)準(zhǔn)曲線（standard curve）——生物樣品中所測(cè)定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性——除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為線性模式，最小二乘法或加權(quán)最小二乘法回歸。 線性范圍：標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高Cmax與最低濃度Cmax/20的區(qū)間——模擬生物樣品的測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度,標(biāo)準(zhǔn)曲線要求,標(biāo)準(zhǔn)曲線——用模擬生物樣品（與待測(cè)的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)）建立——線性范圍

24、(不包括零點(diǎn))應(yīng)能覆蓋全部生物樣品的藥物濃度——不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度,標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,以待測(cè)藥物的檢測(cè)響應(yīng)(如色譜峰面積或峰高) 或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)響應(yīng)的比值(內(nèi)標(biāo)法)(因變量， y )對(duì)模擬血藥濃度 (自變量，x)——求得回歸方程( y＝a＋bx )及其相關(guān)系數(shù)，( ? ) ?≥0.99(色譜法)或≥0.98(生物學(xué)方法) 要求最低濃度點(diǎn)的偏差在±20%以內(nèi)、其余各

25、濃度點(diǎn)的偏差在±15%以內(nèi)。,（三）、定量下限,——系指在保證具有一定可靠性(準(zhǔn)確度與精密度符合要求)的前提下，能測(cè)定出生物樣品中藥物的最低濃度，又稱為方法靈敏度——標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)(最低濃度點(diǎn)≥LOQ)要求——應(yīng)能滿足測(cè)定3～5個(gè)消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度；準(zhǔn)確度在80%～120%；RSD＜20%,（四）、精密度與準(zhǔn)確度,方法準(zhǔn)確度——系指用該方法測(cè)得的生物樣品中待測(cè)藥物的濃度與其真實(shí)濃度的接近程

26、度——應(yīng)使用實(shí)際生物樣品測(cè)定，但實(shí)際生物樣品的濃度是未知的，所以通常使用模擬生物樣品測(cè)定——一般用相對(duì)回收率表示,測(cè)定： 取高(接近上限)、中、低（定量下限的3倍以內(nèi)）3個(gè)濃度，每一濃度至少5個(gè)樣本，與隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線同法測(cè)定、計(jì)算方法回收率 限度要求：——相對(duì)回收率應(yīng)在85%～115% (LOQ附近80%～120%)——RE在±15% (LOQ附近為±20%

27、),方法精密度(precision )——系指每次測(cè)定結(jié)果與多次測(cè)定的平均值的偏離程度——表示該分析方法的可重復(fù)性——反映分析方法的可操作性，是方法驗(yàn)證的基本要點(diǎn)實(shí)際生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.5～2ml)——使用模擬生物樣品測(cè)定,測(cè)定法,照準(zhǔn)確度項(xiàng)下方法，取空白生物基質(zhì)(如血漿)數(shù)份，分別在同一批內(nèi)和不同批間制備高、中、低 3個(gè)濃度的QC樣品，并分析測(cè)定批內(nèi)RSD——每一濃度5個(gè)樣品，每個(gè)樣品

28、測(cè)定1次，用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算3個(gè)濃度及RSD 批間RSD ——每1分析批內(nèi)每一濃度制備1個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定1次；在不同天連續(xù)制備并測(cè)定3 個(gè)合格的分析批，至少45 個(gè)樣品。,限度要求,在藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究中對(duì)?g/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)≤10%ng/ml級(jí)水平的RSD一般應(yīng)≤15%在LOQ 附近RSD應(yīng)≤20%。,（五）、樣品穩(wěn)定性,穩(wěn)定性——包括短期穩(wěn)

29、定性和長期穩(wěn)定性 生物樣品的存放條件和時(shí)間；凍-融循環(huán)(3次），每次冷凍時(shí)間應(yīng)在24h以上；復(fù)溶溶劑中的穩(wěn)定性,（六）、萃取回收率,萃取回收率與相對(duì)回收率的意義不同 萃取回收率——考察生物樣品預(yù)處理過程造成的藥物的損失程度,取空白生物基質(zhì)(如血漿)，照準(zhǔn)確度項(xiàng)下方法，制備高、中、低3個(gè)濃度的QC樣品(每一濃度至少5個(gè)樣品)，每個(gè)樣品分析測(cè)定1次另取等量的相同3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后

30、的殘?jiān)娜軇┫♂屩镣w積，同法測(cè)定AT——經(jīng)萃取后的QC樣品的檢測(cè)信號(hào)AS——未經(jīng)萃取的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)信號(hào),,限度要求,萃取回收率一般應(yīng)≥60%高、中濃度的RSD應(yīng)≤15%低濃度的RSD應(yīng)≤20%。,,（七）、分析過程的質(zhì)量控制 方法考察完畢后作實(shí)際生物樣品的測(cè)定，用空白生物介質(zhì)加入待測(cè)藥物對(duì)照品配制已知濃度樣品，考察方法穩(wěn)定性，推薦由獨(dú)立的人員配制不同濃度的QC樣品對(duì)分析方法進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。

31、 每天建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用于計(jì)算當(dāng)天測(cè)定藥物濃度，并隨行測(cè)定高、中、低3個(gè)濃度的QC樣品。,（八）、未知生物樣品濃度超出定量范圍的處理 1、濃度高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限：分取部分樣品用相應(yīng)的空白生物介質(zhì)稀釋至方法可測(cè)濃度范圍后重新測(cè)定。 2、濃度低于定量限：可增加未知樣品的體積，但應(yīng)在相同的條件下制備QC樣品，驗(yàn)證方法的特異性、準(zhǔn)確度、精密度。在藥代測(cè)定時(shí)刻不必處理，達(dá)峰前以0計(jì)，達(dá)峰后以無法定量（not detectabl