免疫細胞功能的測定

1、免疫細胞功能的測定,上海交通大學醫(yī)學院胡翊群主任醫(yī)師,T細胞增殖功能測定,基礎理論 本技術用于評估T細胞對各種刺激的增殖能力。T細胞增殖能力是反映T細胞功能的一個重要指標。,免疫細胞功能的測定,T細胞功能的測定,刺激T細胞增殖的因素及意義 1. 特異性抗原： 引起寡克隆活化增殖。 克用于判斷抗原免疫的效果（疫苗接種）和回憶反應能力，也能反映T細胞總體的功能。 2. 絲裂原：多克隆。 3. 刺激信號轉導

2、分子：多克隆。,T細胞增殖功能測定,T細胞增殖測定方法1. 顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與細胞計數(shù)。2. 放射性核素摻入試驗。 細胞增殖時，DNA復制，須從培養(yǎng)液中補充核苷酸。用放射性核素標記培養(yǎng)液中提供的胸腺嘧啶（3HTdR），當DNA復制時， 3HTdR摻入正在分裂的細胞的DNA中。細胞增殖程度與細胞內摻入的3HTdR的量成正比。通過用液閃儀定量測定培養(yǎng)細胞中的放射性強度，就可以確定T細胞增殖的能力與強度。,絲裂原誘導的增

3、殖反應,誘導T細胞增殖反應的絲裂原 1. PHA（植物血凝素） 2. Con A（刀豆蛋白 A） 3. PMN（美洲商陸）,T細胞增殖功能測定,絲裂原誘導的增殖反應,技術方法1. 用RPMI－10將PBMC配成1x106/ml的懸液。2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀釋液。3. 96孔板中選擇一行（共12孔），每孔中加入100µl細胞。指定每相鄰3孔為一組。

4、前3組分別加入一種稀釋度的PHA溶液，最后一組加培養(yǎng)液（對照組）。4. 37°C ，5％CO2，54h。5. 配制濃度為50µci/ml的3HTdR。,T細胞增殖功能測定,絲裂原誘導的增殖反應,6. 每孔加入50µci 3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng)18h。7. 用多孔自動收集儀分別收集每孔細胞于一小管中。溶解細胞，將DNA過濾到濾紙上，洗去未摻入的3HTdR，最后用100％的甲醇洗滌，以利濾紙干燥。8.

5、將濾紙放入液閃管內，自動計數(shù)，打印結果。9. 扣除本底，計算每一組3個復本的平均數(shù)。,T細胞增殖功能測定,絲裂原誘導的增殖反應,影響因素1. 細胞活力：冷凍技術影響細胞活力，復蘇后應檢查細胞活力。2. 培養(yǎng)液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制細胞增殖。如欲測定人體細胞增殖能力，可采用滅活的AB血清。3. 細胞培養(yǎng)板類型：根據(jù)細胞數(shù)量采用不同形狀底部的培養(yǎng)板。4. 微生物污染：可降低細胞增殖能力。,T細胞增殖功能測定,單向混合

6、淋巴細胞培養(yǎng)反應,原理 T細胞受體能夠識別同種異型MHC分子。當把2個不同個體的單個核細胞在體外混合時，可以相互刺激，引起增殖。增殖的強度與兩者之間MHC的差別的程度成正比。所以同種異型混合淋巴細胞反應的強度反映2個個體之間MHC差別的程度，并且因為相互識別與增殖，結果是2個個體的淋巴細胞增殖能力的總和。這種試驗就是雙向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗。 將參加反應之一方的單個核細胞用放射性核素照射，使其失去反應能力，但

7、仍保存刺激能力，成為刺激細胞，則此時的反應結果僅反映另一方（反應方）的增殖能力。在實質性器官移植時，只需了解受者淋巴細胞對供者MHC的反應能力，所以適合采用單向混合淋巴細胞培養(yǎng)反應。,T細胞增殖功能測定,單向混合淋巴細胞培養(yǎng)試驗,方法 1. 分離宿主與供者的PBMC，調整細胞濃度為1 x 106/ml。 2. 刺激細胞滅活：用絲裂霉素（終濃度25µg，37 °C， 5％C，30min）或放射性核素照射（200

8、0 rad）的方法處理刺激細胞。 3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激細胞和1x105反應細胞。 37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng)18h。陽性對照孔加反應細胞和絲裂原，不加刺激細胞。陰性對照孔只加照射的自身細胞。3復本。 4. 收集細胞，液閃儀計數(shù)，打印結果。,T細胞增殖功能測定,單向混合淋巴細胞培養(yǎng),5. 計算相對反應（RR） （實驗組cpm－陰性對照組c

9、pm） RR＝ 陽性對照組cpm－陰性對照組cpm,,T細胞增殖功能測定,單向混合淋巴細胞培養(yǎng),注意點 1. 細胞活力：使用冷凍細胞時，復蘇后應檢查細胞活力。 2. 培養(yǎng)液中添加的血清：有的血清可能會刺激或抑制反應。 3. 本底應小于2000 rpm，陽性對照組應大于20000 rpm。,T細胞增殖功能測定,抗原誘導的特異性增殖反應,原理 本試驗測定T細胞在體外對

10、某一特定抗原的特異性免疫應答能力。所用抗原可以是初次接觸的抗原，也可以是曾經免疫過的抗原。常用的測定回憶反應的抗原有純化蛋白衍生物（PPD）和破傷風類毒素（TT）。這2種抗原都被常規(guī)列入計劃免疫接種范疇，成人應該對它們有回憶反應。在某些免疫缺陷病中，對它們的特異性回憶反應可減弱或消失。,T細胞增殖功能測定,,,,,,,抗原誘導的特異性增殖反應,方法（以T細胞對破傷風類毒素刺激的增殖反應為例）1. 分離PBMC和APC，APC用絲裂霉素

11、或放射性核素處理。2. 96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。3. 每孔中加入系列稀釋的破傷風類毒素溶液，不同孔中抗原終濃度分別為0、1、5、10和20µg/ml。每一種濃度設3復本。4. 37C°，5％CO2，6天。5. 加3HTdR，繼續(xù)培養(yǎng)18小時。計數(shù)。,T細胞增殖功能測定,抗原誘導的特異性增殖反應,結果解釋1. 對于接種過破傷風疫苗者來說，本試驗結果呈低反應反映患者對破傷風類

12、毒素特異性應答能力低下或全身免疫缺陷。2. HIV感染者反應低下反映CD4+T細胞減少導致的免疫缺陷。,T細胞增殖功能測定,抗原誘導的特異性增殖反應,注意點1. 培養(yǎng)液中最好用人AB血清。2. 此T細胞增殖反應需要APC。如使用純化T細胞，需加5％～10％自身APC。,T細胞增殖功能測定,抗原誘導的特異性增殖反應,應用實踐1. 絲裂原誘導的增殖反應 臨床上用于評估T細胞對多克隆刺激劑的增殖能力，反映T細胞基本免

13、疫功能，即T細胞群總體的信息，不能反映個別T細胞克隆的情況 PHA常用于測試人T細胞增殖能力，Con A常用于測試小鼠T細胞增殖能力。,T細胞增殖功能測定,抗原誘導的特異性增殖反應,應用實踐2. 單向混合淋巴細胞反應 1）本方法主要用于估計器官移植前供體與受者之間MHC相配程度。 2）如培養(yǎng)時間超過96 小時，可制備細胞毒性T細胞（CTL）。,T細胞增殖功能測定,抗原誘導的特異性增殖反應

14、,應用實踐 3. 抗原誘導的特異性增殖反應 用于估計機體對特異性抗原的應答能力和機體總體免疫應答能力。,T細胞增殖功能測定,B細胞產生抗體能力的測定,基礎理論 B細胞受到多克隆激活劑或特異性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化成為漿細胞，產生抗體?？贵w可以在血漿和其他體液中檢出，檢測抗體是測定B細胞功能的最重要的方法。 B細胞分類：B1細胞和B2細胞。兩者發(fā)生學不同、接受刺激的抗原不同，對T細胞的依

15、賴性不同。 由于B2細胞對抗原的應答依賴T細胞，所以，B細胞產生抗體能力的低下，其缺陷也可能起源于T細胞缺陷。,絲裂原誘導多克隆抗體產生能力的測定,基礎理論 人B細胞具有PWM受體，在體外受到PWM刺激時，發(fā)生多克隆激活，產生多克隆抗體。B細胞產生抗體的能力可以用ELISA測定培養(yǎng)上清中抗體的量估計，也可以用ELISPOT方法測定產生抗體的B細胞數(shù)量估計。,B細胞產生抗體能力的測定,絲裂原誘導多克隆抗體產生

16、能力的測定,技術方法與評價1. 分離PBMC96孔板中每孔加入1x105細胞和PWM終濃度（1：100）。陰性對照孔內不加pWM。每一實驗設2 復本。2. 37C°5％CO2培養(yǎng)10天（ELISA）或7天（ELISPOT）。3. 收集上清，用ELISA法測抗體。收集細胞，用ELISPOT法測產生抗體的B細胞。,B細胞產生抗體能力的測定,絲裂原誘導多克隆抗體產生能力的測定,應用實踐1. 用于確定B細胞活化和分化的信號轉導

17、機制，以及細胞因子和其它銀子對B細胞分化的影響。2. 因為B2細胞產生抗原需要T細胞輔助，所以又可以用于檢測T細胞的輔助功能。3. 臨床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B細胞分化異常的機制。,B細胞產生抗體能力的測定,絲裂原誘導多克隆抗體產生能力的測定,注意點 采用以抗體為基礎的技術（如磁珠法、淘洗法和流式細胞儀）分離的B細胞，需考慮抗體對B細胞產生抗體的影響（促進或抑制作用）。,B細胞產生抗體能力的測定,EL

18、ISPOT法,基礎理論 ELISPOT全稱為酶聯(lián)免疫斑點試驗（enzyme－linked immunospot assay），可用于測定產生IgG和IgM抗體的B細胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特異性B細胞。如果B細胞產生抗體，抗體與板上的抗原結合。加入酶標二抗和顯色劑就會顯色。一個斑點就代表一個產生抗體的細胞。,B細胞產生抗體能力的測定,ELISPOT法,技術方法1. 抗原包被：37C°2h，或4C

19、°過夜。固相載體可用聚苯乙烯平皿、亞硝酸纖維膜、96孔板。2. 抗體生成細胞培育：加入適量抗體生成細胞，37C°，5％CO2，3～4h，或過夜。洗滌，去除為與固相結合的細胞。3. 測定斑點產生細胞：加二抗， 37C°，5％CO2，2～3h。加辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶和底物顯色。4 計數(shù)：24h后用10～30倍顯微鏡下計數(shù)斑點形成細胞。,B細胞產生抗體能力的測定,ELISPOT法,評價1. 在操作中

20、應使用無關抗原作陰性對照；病應排除細胞標本終抗體污染。2. 硝酸纖維素膜靈敏度高于聚苯乙烯。3. 與ELISA聯(lián)合使用，可以估計單個細胞的抗體產量。4 當淋巴細胞受到嚴重污染時，也可以使用本法，所以適用于測定組織中抗體生成細胞。應用實踐用途同ELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。,B細胞產生抗體能力的測定,ELISA測定各類免疫球蛋白,基礎理論 B細胞受抗原刺激后，最初產生IgM抗體，然后在Th細胞產生的

21、各種細胞因子的作用下，可轉類成為IgG、IgA、IgE類抗體。應用不同的單抗，結合ELISA方法，可以測定B細胞產生的抗體的類別。,B細胞產生抗體能力的測定,ELISA測定各類免疫球蛋白,方法1. 包板：96孔板用濃度為10µg/ml的特異性單抗包被。蓋上蓋板，37C°，5％CO2，2h，或4C°過夜。常規(guī)洗板，封閉。2. 上樣：每孔內加入1:10或1:20 稀釋的細胞培養(yǎng)上清液100µl。陽

22、性對照為標準品，陰性對照為培養(yǎng)液。每試驗設2復本。室溫培育2h，或4C°過夜。3. 加酶標二抗：每孔加100µl堿性磷酸酶標記的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室溫培育2h，或4C°過夜。4. 顯色：洗板，每孔加100µl底物（p－nitrophenyl phosphate）。5. 自動酶標儀讀數(shù)，從標準曲線讀出抗體濃度。,B細胞產生抗體能力的測定,ELISA測定各類免疫球蛋白,評價

23、 ELISA法靈敏、簡單、快速、特異性高、重復性好，是測定上清和體液中Ig的首選方法。堿性磷酸酶標記的二抗顯色明顯，不必用堿中止反應，尤其適用于測定體外產生的抗體。應用實踐 ELISA可測定各種體液中的抗體，其結果反映被檢個體B細胞功能。測定免疫球蛋白各種亞類的水平有助于鑒定免疫缺陷病。,B細胞產生抗體能力的測定,CTL殺傷功能的測定,基礎理論 CTL為細胞毒性T淋巴細胞的簡稱。是CD8＋T

24、細胞識別APC表面MHC I類分子遞呈的腫瘤或病毒特異性抗原肽后，分化形成的。當CTL遇到相應的腫瘤細胞或病毒感染細胞時，能夠通過細胞接觸機制或裂解機制殺傷靶細胞。,CTL殺傷功能的測定,1. 細胞接觸機制 CTL表達FasL，靶細胞表達Fas，F(xiàn)asL與Fas的配接，通過Fas傳入的信號激活靶細胞內細胞凋亡途徑，導致靶細胞死亡。2. 細胞裂解機制 CTL激活后，胞質內顆粒向2個細胞接觸點移動。顆粒膜與細

25、胞膜融合通過外吐釋放顆粒內容物。穿孔素插入靶細胞膜后聚合，喜愛細胞膜上形成孔，造成細胞裂解。顆粒酶誘導靶細胞凋亡。,CTL殺傷功能的測定,51Cr標記法原理 如在將靶細胞與CTL混合之前，先用放射性核素51Cr培育， 51Cr能穿過細胞膜進入胞漿，與胞漿中小分子蛋白質牢固結合，不能自由從細胞內釋放。當靶細胞膜被CTL破壞后， 51Cr被釋放進入上清。因為上清中放射性強度與細胞殺傷程度呈正比，通過測定上清中放射性強度，就可以

26、判定CTL殺傷能力。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,CTL殺傷功能的測定,技術方法1. 從腫瘤組織中分離淋巴細胞和腫瘤細胞。2. 51Cr標記腫瘤細胞。3. 96孔培養(yǎng)板每孔中加入淋巴細胞和靶細胞，效：靶比為50:1，25:1，12.5:1。另設最大釋放對照（靶細胞加去污劑）和自發(fā)釋放對照（不加CTL）。4. 37C°，5％CO2，4h。5. 收集上清，?計數(shù)器測定放射活性（cpm）。,CTL殺傷功能的測定,

27、計算公式 試驗組平均CPM值－自發(fā)釋放組平均cpm值％溶解＝ 最大釋放平均cpm值－自發(fā)釋放平均cpm值注意點由于CTL殺傷靶細胞受MHC限制，所以靶細胞必須來自自身，或選用表達適當MHC的腫瘤細胞系。評價優(yōu)點：方法簡單、快速，能定量。缺點：自然釋放率較高，需要的靶細胞量多。使用放射性核素。,,CTL殺傷功能的測定,應用實踐這一方法常用于評估腫瘤患者CTL殺傷

28、腫瘤的能力，可作為判斷雨后和觀察療效的指標之一。,NK細胞毒性測定,基礎理論 NK細胞存在于外周血、淋巴組織中，尤以脾臟最為豐富。因細胞體積大和胞漿內含大量顆粒，故稱大顆粒淋巴細胞。表型特征是CD16（Fc?RIII A）和CD56（神經細胞粘附分子）。當NK細胞識別腫瘤細胞活病毒感染細胞時，CD16分子被交聯(lián)，引起脫顆粒，并分泌IFN－?和TNF。顆粒中含有穿孔素、顆粒酶和proteoglycans，引起靶細胞溶脹性死

29、亡和凋亡。NK細胞的CD16與IgG1和IGg3結合，可介導ADCC作用。 NK細胞表達一種能識別HLA－A、－B、－C抗原的受體，向細胞發(fā)出一致性信號，阻止NK細胞的殺傷活性。當靶細胞不表達或低表達HLA I類分子時，抑制解除，NK細胞活化，殺傷靶細胞。 K562細胞系不表達HLA分子，對NK細胞殺傷作用敏感，常用作NK細胞的靶細胞，用于檢測NK細胞的活性。,NK細胞毒性測定,技術方法1. NK細胞的分離

30、：用抗CD3、CD19、CD14單抗和淘洗法，去除T細胞、B細胞和Mo，獲取NK細胞。2. 加板： 方法同CTL殺傷試驗。不同的是，靶細胞為K562細胞。最大釋放組為靶細胞中加去污劑，自發(fā)釋放對照組中不加Nk細胞。37C°，5％CO2，4h。3. 收集上清液，?計數(shù)器測各孔cpm值。4. 計算％溶解值：方法同CTL法。,NK細胞毒性測定,評價1. 本方法穩(wěn)定，但51Cr污染環(huán)境。2. 從外周血中 分離的NK細胞是靜止

31、細胞，只能殺死對峙敏感的K562細胞系，不能殺傷其它腫瘤細胞。3. 冷凍保存影響NK細胞活性，故宜采用新鮮分離的NK細胞。4. 人血清中含有的IgG會抑制NK細胞的殺傷活性，故培養(yǎng)液中宜使用小牛血清。,NK細胞毒性測定,應用實踐 檢測NK細胞免疫活性。在疾病狀態(tài)下，NK細胞的功能會受到影響。,LAK細胞毒性測定,基礎理論 LAK細胞是淋巴因子激活殺傷細胞的簡稱。NK細胞在大劑量IL－2刺激下擴增并分

32、化成為LAK細胞。LAK細胞對新鮮分離的腫瘤細胞或腫瘤細胞系具有非特異性殺傷作用。臨床上用LAK細胞過繼性治療某些腫瘤患者，例如腎細胞癌、黑色素瘤合霍奇金病，有一定療效。,LAK細胞毒性測定,技術方法1. 制備：抽取患者外周血20ml，分離PBMC。培養(yǎng)皿中加入重組IL－2，是終濃度為100U/ml。37C°，5％CO2，培養(yǎng)，每3～4天換液；細胞數(shù)增加時分瓶。2. 培養(yǎng)7～10天。收集細胞，計數(shù)。細胞需要量為109～10