輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能的研究.pdf

1、第一部分大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 目的：分離培養(yǎng)并鑒定大鼠脾臟巨噬細(xì)胞。 方法：SD大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉，無(wú)菌取脾臟，制備成脾臟組織細(xì)胞混懸液，裂解脾臟組織細(xì)胞混懸液中的紅細(xì)胞；用RPIM-1640培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中，在37℃，50ml·l-1CO2，100％濕度中分別培養(yǎng)1、2、3、6、12、24h，洗滌未貼壁細(xì)胞，相差顯微鏡下分別觀察脾臟巨噬細(xì)胞的貼壁情況，確定最佳細(xì)胞貼壁時(shí)間。應(yīng)用免

2、疫組織化學(xué)等方法進(jìn)行細(xì)胞的鑒定；臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力，瑞氏染色鑒定細(xì)胞純度。 結(jié)果：1.大鼠脾臟組織經(jīng)過研磨等處理后，得到大量的脾細(xì)胞混懸液，可以滿足進(jìn)一步的分離培養(yǎng)的需要；2.觀察貼壁細(xì)胞，1-3h細(xì)胞少量貼壁，12h左右的貼壁細(xì)胞增多，24h的貼壁細(xì)胞減少。12h是貼壁細(xì)胞合適時(shí)間；3.相差顯微鏡下觀察到貼壁培養(yǎng)的脾臟巨噬細(xì)胞多為圓形或橢圓形，少數(shù)呈梭形或多邊形。鏡下觀察細(xì)胞體積較大，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核清晰可見，胞漿內(nèi)容物

3、豐富；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示貼壁的脾臟巨噬細(xì)胞CD68表達(dá)陽(yáng)性，提示所得的細(xì)胞是脾臟巨噬細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞活力>95％，瑞氏染色鑒定細(xì)胞純度>90％。 結(jié)論：1分離培養(yǎng)出活力和純度符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠脾臟巨噬細(xì)胞；2.貼壁12h是大鼠原代脾臟巨噬細(xì)胞的合適貼壁培養(yǎng)時(shí)間。 第二部分輕度熱應(yīng)激對(duì)大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能的影響 目的：探討輕度熱應(yīng)激對(duì)大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。 方法：以始終處于37℃的大

4、鼠原代脾臟巨噬細(xì)胞作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組將大鼠原代脾臟巨噬細(xì)胞置于41℃恒溫箱中，使細(xì)胞輕度熱應(yīng)激1h，然后恢復(fù)到37℃，分成應(yīng)激后0min，30min，60min，120min，180min五個(gè)亞組組，總共六個(gè)組；以吞噬中性紅能力（OD540nm值）檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬功能、噻唑藍(lán)法測(cè)定巨噬細(xì)胞對(duì)L1210細(xì)胞的殺傷作用來(lái)反應(yīng)巨噬細(xì)胞的殺傷活性，Transwell小室趨化裝置觀察巨噬細(xì)胞趨化活性變化；采用雙抗夾心ABC-ELISA法檢測(cè)大鼠

5、脾臟巨噬細(xì)胞分泌的TNF-a，IL-12濃度的變化。 結(jié)果：輕度熱應(yīng)激（41℃、1h）后，實(shí)驗(yàn)組大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的功能均發(fā)生了變化，而且與應(yīng)激后恢復(fù)時(shí)間有關(guān)。熱應(yīng)激后0min，巨噬細(xì)胞的OD540nm值由正常的0.21±0.01上升到0.34±0.01（p<0.05），然后繼續(xù)上升，至60min達(dá)最高值0.81±0.04（p<0.01），隨后逐漸下降，應(yīng)激后180min仍然有0.47±0.03（與對(duì)照組比較，p<0.05）；殺傷

6、活性由正常的35.30±4.37％上升到應(yīng)激后0min的45.00±4.74％（p<0.05），在60min分鐘達(dá)到最大值82.07±5.17％（p<0.01），隨后逐漸下降，180min后殺傷活性基本恢復(fù)正常，為37.27±5.11％（與對(duì)照組比較，p>0.05）；趨化作用也呈現(xiàn)大致相同的變化趨勢(shì)，大鼠脾臟巨噬細(xì)胞正常趨化活性為23.40±5.32/HP；熱應(yīng)激1h后0min為34.60±5.22/HP（p<0.05），在60min分

7、鐘達(dá)到最大值60.80±4.02/HP（p<0.01）后逐漸下降，180min仍為31.60±4.21/HP（與對(duì)照組比較，p<0.05）；在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，大鼠脾臟巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-12均隨著應(yīng)激后時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，180min達(dá)到最高（與對(duì)照組比較，P<0.01）。 結(jié)論：輕度熱應(yīng)激后，大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的吞噬功能、殺傷活性、趨化活性都有上調(diào)；在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，大鼠脾臟巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TNF-α和IL-12在輕度熱

8、應(yīng)激后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。提示輕度熱應(yīng)激對(duì)大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的免疫功能有促進(jìn)作用。 第三部分 Bip蛋白在輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞中的表達(dá)與意義 目的：探討輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞Bip蛋白的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞功能改變的影響。 方法：原代培養(yǎng)大鼠脾臟巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞置于41℃恒溫箱中，使細(xì)胞輕度熱應(yīng)激，1h后恢復(fù)到37℃，分別檢測(cè)應(yīng)激后0min，30min，60min，120min，180min巨噬細(xì)胞BipmR

9、NA、Bip蛋白的表達(dá)：同時(shí)段分別檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能、殺傷活性和趨化作用。 結(jié)果：（1）輕度熱應(yīng)激后，大鼠脾臟巨噬細(xì)胞BipmRNA的表達(dá)明顯增加，30min后到達(dá)高峰，60min、120min時(shí)仍高于對(duì)照組（p<0.01），180min后恢復(fù)至正常水平。Bip蛋白的表達(dá)在輕度熱應(yīng)激60min后到達(dá)高峰，120min、180min時(shí)仍高于對(duì)照組（p<0.05）。（2）輕度熱應(yīng)激后，大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的吞噬功能、殺傷活性和趨化作用

10、均明顯增強(qiáng)，且與BipmRNA、Bip蛋白表達(dá)的改變基本同步。 結(jié)論：輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞BipmRNA、Bip蛋白的表達(dá)與巨噬細(xì)胞功能發(fā)生同步改變，提示Bip蛋白表達(dá)上調(diào)與輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞功能增強(qiáng)可能有關(guān)。 第四部分 BiP反義寡核苷酸對(duì)輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能的影響 目的：探討B(tài)ip反義寡核苷酸對(duì)體外輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞功能的影響，進(jìn)一步證實(shí)Bip在輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞功

11、能改變中的作用。 方法：設(shè)計(jì)特異性Bip寡核苷酸，反義序列為5’-CTTTGTCCTAGCCGCTCG-3’；錯(cuò)義序列為5’-CTTTGTCCTAGCCGCTCG-3’。通過脂質(zhì)體包裹后將其轉(zhuǎn)染至小鼠脾臟巨噬細(xì)胞，觀察Bip反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后及未轉(zhuǎn)染組、Bip錯(cuò)義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后大鼠脾臟巨噬細(xì)胞BipmRNA的改變：然后分別觀察正常對(duì)照組、輕度熱應(yīng)激組和Bip反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染并輕度熱應(yīng)激后脾臟巨噬細(xì)胞功能的改變。 結(jié)果：B

12、ip反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染大鼠脾臟巨噬細(xì)胞后，與未轉(zhuǎn)染組和錯(cuò)義組比較，輕度熱應(yīng)激后BipmRNA的表達(dá)明顯減少；大鼠脾臟巨噬細(xì)胞吞噬功能、趨化活性和殺傷活性明顯回落（P<0.01）。 結(jié)論：Bip反義寡核苷酸可顯著抑制大鼠脾臟巨噬細(xì)胞BipmRNA的表達(dá)，并可降低輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞吞噬功能、趨化活性和殺傷活性。Bip對(duì)輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞的免疫功能有促進(jìn)作用。 第五部分 P38MAPK信號(hào)途徑在輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟

13、巨噬細(xì)胞免疫功能改變中的作用 目的：研究MAPK信號(hào)途徑在Bip蛋白介導(dǎo)的體外輕度熱應(yīng)激大鼠脾臟巨噬細(xì)胞免疫功能改變中的作用。 方法：P38MAPK抑制劑預(yù)處理大鼠脾臟巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞置于41℃恒溫箱中，使細(xì)胞輕度熱應(yīng)激，1h后恢復(fù)到37℃（抑制組），以未應(yīng)激（對(duì)照組）和單純41℃熱應(yīng)激1h后60min大鼠脾臟巨噬細(xì)胞（應(yīng)激組）為對(duì)照，分別檢測(cè)三組大鼠脾臟巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷、趨化功能。同時(shí)檢測(cè)P38MAPK蛋白和Bip蛋

14、白的表達(dá)。 結(jié)果：輕度熱應(yīng)激后60min，應(yīng)激組大鼠脾臟巨噬細(xì)胞吞噬、趨化和殺傷活性增強(qiáng)，與對(duì)照組、抑制組比較差異有顯著性（P<0.01）。P38MAPK抑制劑預(yù)處理大鼠脾臟巨噬細(xì)胞，與應(yīng)激組比較，熱應(yīng)激后巨噬細(xì)胞吞噬、趨化和殺傷活性明顯降低（P<0.01），與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。應(yīng)激組P38MAPK蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與對(duì)照組和抑制組比較差異有顯著性（P<0.01）；P38MAPK抑制劑預(yù)處理后，抑制組P38M

15、APK蛋白表達(dá)受到抑制，與應(yīng)激組比較（P<0.01）。Bip蛋白的表達(dá)也因P38MAPK抑制劑預(yù)處理而發(fā)生改變，由應(yīng)激組的1.2702±0.5345（Bip/β-actin）下降到抑制組的1.0281±1.0614（P<0.05）。 結(jié)論：輕度熱應(yīng)激可增強(qiáng)大鼠巨噬細(xì)胞吞噬、趨化和殺傷作用的同時(shí)，P38MAPK、Bip蛋白表達(dá)上調(diào)。P38MAPK抑制劑可顯著抑制大鼠巨噬細(xì)胞吞噬、趨化和殺傷功能以及P38MAPK、Bip蛋白的表達(dá)。