囊藻毒素-LR在斑馬魚(yú)體內(nèi)慢性毒性機(jī)制的研究.pdf

1、微囊藻毒素-LR（縮寫為MCLR）為水體中毒性最強(qiáng)、最經(jīng)常爆發(fā)的一種毒素，該毒素對(duì)生物體呈多種毒性效應(yīng)（如肝毒性和神經(jīng)毒性），然而其毒性作用機(jī)制至今還不清楚。鑒于此，本研究工作以斑馬魚(yú)D.rerio為研究對(duì)象，進(jìn)行不同低濃度MCLR（空白對(duì)照組、2和20μg/L毒素處理組，暴露時(shí)間為取斑馬魚(yú)的肝臟和大腦30d）慢性脅迫下魚(yú)體內(nèi)肝臟和大腦的蛋白質(zhì)組學(xué)研究;即暴露30 d后，采用雙向凝膠電泳(Two-dimensional electrop

2、horesis，簡(jiǎn)寫為2-DE)和基質(zhì)輔助電離解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight/time-of-flight mass spectrometer，簡(jiǎn)寫為MALDI-TOF/TOF-MS)等方法，研究MCLR脅迫下兩種組織蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜所發(fā)生的變化，找出發(fā)生顯著變化的差異蛋白點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行功能鑒定，繼而揭示了由MCLR毒性引起的蛋白質(zhì)組的變化

3、;另外，本文測(cè)定了肝臟和大腦對(duì)MCLR的累積量及其蛋白磷酸酶(Protein phosphatase，簡(jiǎn)寫為PP)的活性，同時(shí)也從超微結(jié)構(gòu)水平來(lái)探討MCLR所誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞損傷程度。該研究工作旨在探討MCLR對(duì)魚(yú)類的慢性毒害效應(yīng)及其毒性機(jī)制，同時(shí)為可特異地指示MCs污染的生物標(biāo)志物的篩選提供理論和實(shí)踐依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、暴露結(jié)束后，毒素脅迫顯著提高處理組斑馬魚(yú)肝臟內(nèi)MCLR的累積量和PP活性，如空白對(duì)照組中沒(méi)有檢

4、測(cè)到MCLR的含量，而2和20μg/L毒素處理組的MCLR含量分別為0.031和0.039μg/mg DW;同樣地，相對(duì)于對(duì)照空白組，20μg/LMCLR處理組的PP活性顯著提高2倍。有趣的是，免疫印記實(shí)驗(yàn)表明肝臟內(nèi)蛋白磷酸酶2A(縮寫為PP2A)含量與MCLR處理濃度無(wú)相關(guān)性。MCLR脅迫引起肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的顯著損傷:相對(duì)于空白對(duì)照組，處理組肝臟細(xì)胞內(nèi)粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生普遍的腫脹，伴隨著網(wǎng)槽的擴(kuò)張或空泡化;線粒體也發(fā)生腫脹，許多線粒體失去

5、嵴;最為明顯的是，處理組肝臟細(xì)胞有蜂窩狀結(jié)構(gòu)體的出現(xiàn)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明有22個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在毒素脅迫下發(fā)生顯著的變化;經(jīng)過(guò)鑒定，這些蛋白質(zhì)參與細(xì)胞骨架的組裝、大分子的代謝、氧化脅迫和信號(hào)傳導(dǎo);因此，MCLR慢性肝毒性可引起細(xì)胞骨架組裝和生物大分子代謝的失常，誘導(dǎo)氧化脅迫的出現(xiàn)，伴隨著細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的擾亂。另外，MCLR慢性肝毒性可能啟動(dòng)活性氧（縮寫為ROS）途徑，而不是PP途徑，后者為該毒素急性毒害效應(yīng)的主要機(jī)制。
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6、、暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，毒素脅迫顯著提高斑馬魚(yú)大腦內(nèi)MCLR含量和PP活性，如空白對(duì)照組中沒(méi)有檢測(cè)到MCLR的累積，而2和20μg/L MCLR處理組的毒素含量分別為0.030和0.053μg/mg DW;同樣地，相對(duì)于對(duì)照空白組，20μg/L MCLR處理組的PP活性顯著提高1.3倍。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明大腦內(nèi)有30個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在毒素脅迫下發(fā)生顯著的變化;經(jīng)過(guò)鑒定，這些蛋白質(zhì)參與細(xì)胞骨架的組裝、生物大分子的代謝、氧化脅迫、信號(hào)傳導(dǎo)、以及其

7、它功能（如轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞凋亡和蛋白質(zhì)翻譯）。綜上所述，MCLR的神經(jīng)毒性可引起氧化脅迫、細(xì)胞骨架組裝和大分子代謝的異常，以及伴隨著信號(hào)傳導(dǎo)和其它功能（如蛋白質(zhì)的降解、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡和蛋白質(zhì)翻譯）的紊亂，暗示該毒素對(duì)斑馬魚(yú)大腦神經(jīng)毒性的復(fù)雜性和多樣性。斑馬魚(yú)大腦的PP活性隨著MCLR濃度的增加而升高，可能與毒素脅迫下PP2Cα2的誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)。另外，該研究提示MCLR的慢性神經(jīng)毒性啟動(dòng)于ROS和PP途徑，然而PP途徑與PP2C

8、α2的顯著上調(diào)相關(guān)的。最后，MCLR可能具有內(nèi)分泌干擾物質(zhì)的效應(yīng)，因?yàn)樵摱舅孛{迫顯著地誘導(dǎo)卵黃蛋白原的形成;然而具體原因和機(jī)制的探討有待于進(jìn)一步研究。
　　 值得一提的是，MCLR肝臟毒性和神經(jīng)毒性引起的蛋白質(zhì)組變化很相似，即兩種毒性均顯著影響了參與細(xì)胞代謝、骨架蛋白組裝、氧化脅迫和信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)程，說(shuō)明了MCLR的多種毒性效應(yīng)在某種程度上呈一致性，雖然MCLR神經(jīng)毒性還特異地影響了細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞凋亡和蛋白質(zhì)翻譯的