天然色素生產菌的鑒定[畢業(yè)設計]

1、<p>　　本科畢業(yè)設計(論文)</p><p><b>　?。ǘ?屆）</b></p><p>　　天然色素生產菌的鑒定</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物工程 </p>

2、;<p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要：黑色素是廣泛存在于生物界中的一類色素，是頭發(fā)、皮膚、昆蟲表皮、植物、動物、真菌等表現(xiàn)

3、黑色的本源。本研究主要是從土壤中分離得到一株產黑色素菌株，根據(jù)菌落形態(tài)和常規(guī)生理生化初步鑒定為一株放線菌。為了進一步確定該菌株在分類學上的位置，對其進行16SrRNA的分子鑒定，結果顯示：與鏈霉菌屬的同源性為98%。</p><p>　　關鍵詞：黑色素；菌種鑒定；測序</p><p>　　Abstract: Melanin is a kind of pigment that widely

4、exists in biological. It is black source of the hair, skin, insect cuticle, plants, animals and fungi etc. The study investigated the strain producing black pigment was isolated from soil. The strain was identified by th

5、e shape and general physiological and biochemical properties. The result showed the strain was actinomyces. In order to confirm the location in taxonomy, 16S rRNA sequence of the strain was sequenced and it had the simil

6、arity of </p><p>　　Keywords: black pigment; strain identification; sequencing</p><p><b>　　目 錄</b></p><p>　　摘要 ………………………………………………………………………………………………………錯誤!未定義書簽。</p>

7、;<p>　　Abstract…………………………………………………………………………………………………錯誤!未定義書簽。</p><p>　　1 緒論……………………………………………………………………………………………………錯誤!未定義書簽。</p><p>　　1.1 黑色素的性質 …………………………………………………………………………………1</p>

8、<p>　　1.2 黑色素生產 ……………………………………………………………………………………2</p><p>　　1.2.1 應用分離出的細菌……………………………………………………………………2</p><p>　　1.2.2 發(fā)酵生產………………………………………………………………………………2</p><p>　　1.3 黑色素的代謝調

9、………………………………………………………………………………2</p><p>　　1.3.1 遺傳……………………………………………………………………………………2</p><p>　　1.3.2 巰氫基（-SH） ………………………………………………………………………3</p><p>　　1.3.3 內分泌………………………………………………………………

10、…………………3</p><p>　　1.3.4 紫外線…………………………………………………………………………………3</p><p>　　1.3.5 角朊細胞因子…………………………………………………………………………3</p><p>　　1.4 實驗研究的內容與難點 ………………………………………………………………………3</p><

11、p>　　2 實驗部分………………………………………………………………………………………………5</p><p>　　2.1 實驗材料、藥品和器材………………………………………………………………………5</p><p>　　2.1.1 實驗材料………………………………………………………………………………5</p><p>　　2.1.2 實驗藥品…………

12、……………………………………………………………………5</p><p>　　2.1.2 實驗儀器………………………………………………………………………………5</p><p>　　2.2 菌落及生理生化鑒定…………………………………………………………………………6</p><p>　　2.3.1 菌種培養(yǎng)…………………………………………………………………………

13、……6</p><p>　　2.3.2 基因組提取……………………………………………………………………………6</p><p>　　2.3.3 凝膠電泳………………………………………………………………………………8</p><p>　　2.3.4 PCR擴增………………………………………………………………………………8</p><p>

14、　　2.3.5 切膠回收………………………………………………………………………………9</p><p>　　2.3.6 連接反應 ……………………………………………………………………………10</p><p>　　2.3.7 感受態(tài)細胞的制備 …………………………………………………………………10</p><p>　　2.3.8 轉化反應 ………………………

15、……………………………………………………10</p><p>　　2.3.9 鑒定 …………………………………………………………………………………11</p><p>　　2.3.10 質粒DNA的提取……………………………………………………………………11</p><p>　　3 結果與分析 ………………………………………………………………………………………

16、…12</p><p>　　3.1 菌落及生理生化鑒定 ………………………………………………………………………12</p><p>　　3.2 分子鑒定 ……………………………………………………………………………………12</p><p>　　3.2.1 基因組凝膠電泳圖譜 ………………………………………………………………12</p><p

17、>　　3.2.2 PCR擴增 ……………………………………………………………………………13</p><p>　　3.2.3 轉化反應 ……………………………………………………………………………13</p><p>　　3.2.4 導入后的PCR擴增 …………………………………………………………………14</p><p>　　3.2.5 質粒提取 ……

18、………………………………………………………………………14</p><p>　　3.2.6 基因測序 ……………………………………………………………………………15</p><p>　　3.2.7 構建進化樹 …………………………………………………………………………17</p><p>　　4 結論 ………………………………………………………………………………

19、…………………18</p><p>　　參考文獻…………………………………………………………………………………………………19</p><p>　　致 謝……………………………………………………………………………………………………21</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 黑色素

20、的性質</p><p>　　黑色素是廣泛存在于生物界中的一類色素,它是頭發(fā)、皮膚、昆蟲表皮、植物、動物、真菌等表現(xiàn)黑色的本源[1]。微生物所產黑色素主要分為胞內、壁結合和胞外黑色素[2]。黑色素能作為紫外線吸收劑[3]、抗氧化劑[4]、自由基清除劑[5]、陽離子螯合劑和新型天然的藥物載體，也可以用來治療與黑色素缺乏有關的神經系統(tǒng)疾病如著色性干皮病；具有體外抗HIV 病毒的作用。</p><p&

21、gt;　　黑色素通常不溶于水、酸溶液和普通有機溶劑。黑色素的黑色是因為它吸收所有波長的可見光。黑色素在紫外區(qū)的吸收率最高, 隨著波長的增加而逐漸降低，通常光吸收的降低與波長的增加是呈線性的。因此, 光吸收線性曲線的斜率可作為鑒定自然來源黑色素的特征參數(shù)。研究者認為, 不同類型的黑色素其光吸收斜率值是不同的。但因黑色素氧化后斜率的改變而不能把其作為黑色素分類的依據(jù)[7]。黑色素廣泛存在于人體皮膚、眼睛及其它組織中, 是目前所知道的唯一保護

22、皮膚免受輻射傷害的天然生物聚合體[6]。因此, 它在醫(yī)療、食品和化妝品工業(yè)中的應用潛力巨大。已有研究證明了鏈霉菌所產黑色素對蘇云金芽孢桿(Bacillus thuringiensis 簡稱Bt) 以色列亞種殺蟲活性的光保護作用。國外學者對Bt庫斯塔克亞種進行連續(xù)的紫外誘變, 得到了能產黑色素的Bt突變株[8]。目前已經報道了多種微生物可產生黑色素。</p><p>　　圖1 黑色素結構圖（部分結構）</p

23、><p>　　1.2 黑色素生產</p><p>　　1.2.1 應用分離出的細菌</p><p>　　目前從武漢東湖中分離出一株高產胞外黑色素的細菌(BFHM2002)。BFHM2002 具有產黑色素速度快, 產量高且不需要酪氨酸誘導等優(yōu)點；而且經酪氨酸誘導可顯著提高BF2HM2002胞外黑色素的產量,初步鑒定BFHM2002 屬堅強芽孢桿菌(Bacillus f

24、irmus)。由于BFHM2002 的產黑色素特性, 它將成為芽孢桿菌屬的一個新的菌種資源。</p><p>　　1.2.2 發(fā)酵生產</p><p>　　鏈霉菌是一種很重要的次生代謝物產生菌種，有可能通過基因工程方法, 使同一菌種既能產生黑色素，同時又能產生某種抗生素，通過優(yōu)化其發(fā)酵條件，就可以一次發(fā)酵同時收獲黑色素和抗生素，從而成倍地提高經濟效。 </p><

25、p>　　一定范圍內，OD400nm值與溶液中黑色素含量成正比，可用于比較兩個菌株的產黑色素能力,用酪氨酸誘導可顯著提高該菌株黑色素的產量[17]。通過多種培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵實驗，發(fā)現(xiàn)產黑色素量最高的可達到約0.70g/L，比其它菌株產黑色素都快。其培養(yǎng)特征：在高氏培養(yǎng)基上生長良好，在酵母膏葡萄糖瓊脂上菌落白色, 直徑約1 mm, 表面絨毛狀，并可產胞外黑色素。顯微鏡觀察:光學顯微鏡觀察基質菌絲未見橫隔膜,氣生菌絲豐茂，且氣生菌絲后期斷

26、裂。氣生菌絲上長孢子絲, 孢子絲緊密右手螺旋成假孢囊狀, 電鏡下可見緊密的螺旋, 孢子柱形，表面疣狀(見圖２)。</p><p>　　圖2 在高氏培養(yǎng)基的培養(yǎng)菌絲</p><p>　　注：A: 8天, 60 倍For 8 d, 63 /； B: 21天, 10 000倍For 21 d, 10 000 </p><p>　　1.3 黑色素的代謝調節(jié)</p&

27、gt;<p><b>　　1.3.1 遺傳</b></p><p>　　遺傳基因決定了皮膚的基本膚色。藍眼晴紅頭發(fā)的極白的人種，黑素細胞內黑素小體極少，幾乎沒有第Ⅲ、Ⅳ期黑素化深的黑素小體，在角朊細胞內沒有黑素，而在黑種人主要見到許多第Ⅳ期的黑素小體。</p><p>　　1.3.2 硫氫基(-SH)</p><p>　　表皮

28、中正常存在的-SH 能與酪氨酸酶中的銅離子結合而抑制其機能, 正常時-SH與酪氨酸酶間經常保持一定的平衡關系, 任何使表皮中-SH 減少的因素均可使黑素形成增多。</p><p>　　1.3.3 內分泌</p><p>　　垂體: 中葉分泌的促黑素細胞激素(MSH)能迅速激活酪氨酸酶, 有認為MSH 是通過細胞內環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的增高來激活酪氨酸酶的，cAMP的增高也有利于黑素小體

29、轉運到角朊細胞中去。也有認為MSH能使血清中銅含量增加或使皮膚內-SH 含量減少, 故能使色素增多。促黑素細胞激素（MSH）：有α、β兩種，均為直鏈多肽類激素。α為13肽，β為18肽，產生MSH的細胞分散在垂體前葉，MSH分泌受下丘腦促黑激素釋放因子（MRF）及促黑激素細胞釋放抑制因子（MIF）的影響。</p><p>　　腎上腺: 腎上腺皮質激素在正常情況下通過抑制垂體分泌MSH 而使黑素形成減少, 它還能減低

30、黑素細胞對MSH的感受性。腎上腺髓質激素亦有抑制MSH的作用。</p><p>　　性腺: 黃體酮、雄激素,尤其是雌激素均能直接刺激黑素細胞產生黑素,也可能是由于這些性激素解除了-SH 對酪氨酸酶的抑制作用而使色素增加。</p><p>　　甲狀腺: 甲狀腺素是氧化過程刺激劑，可促進黑色素形成過程中之氧化過程，或能使皮膚中SH 減少, 而使色素增多。</p><p>

31、;　　1.3.4 紫外線</p><p>　　作用：使皮膚中的-SH 氧化破壞而增加酪氨酸酶的活性；直接刺激黑素細胞；發(fā)生光氧化作用使黑素細胞及黑素小體數(shù)量增加，黑素化程度加深，并加速黑素小體的轉運。</p><p>　　1.3.5 角朊細胞因子</p><p>　　角朊細胞釋放的細胞因子如堿性成纖維細胞生長因子、內皮素、干細胞生長因子等分子量高者能刺激黑素細胞

32、的生長, 分子量低者能促進樹枝狀突起的生長及黑素的合成, 如cAMP參與則其作用提高10～20倍。</p><p>　　角朊細胞釋放的白細胞介素6及腫瘤壞死因子對黑素細胞的生長和黑素的合成則有抑制作用。</p><p>　　1.4 實驗研究的內容與難點</p><p>　　本課題研究的內容是：篩選產黑色素的菌株；提取其基因組DNA；采用通用引物，擴增16sRNA片

33、段；對擴增產物進行測序，在數(shù)據(jù)庫中進行對比，確定該菌種屬及其親緣關系。</p><p>　　該課題在進行實際操作時，主要的難點是基因組DNA的純度難掌握和PCR過程中條件的掌握，因為擴增條件直接影響擴增的16SrRNA序列。</p><p><b>　　2 實驗部分</b></p><p>　　2.1 實驗材料、藥品和器材</p>

34、;<p>　　2.1.1 實驗材料</p><p>　　產黑色素細菌，剛剛篩選出的，大腸桿菌，來自實驗室</p><p>　　2.1.2 實驗藥品</p><p><b>　　表2-1 實驗藥品</b></p><p>　　2.1.3 實驗儀器</p><p><b>

35、;　　表2-2 主要儀器</b></p><p>　　2.2 菌落及生理生化特性鑒定</p><p>　　經過固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，觀察菌落特征，經過制片鏡檢。進行革蘭氏染色觀察細菌形態(tài)，測量菌體大小。查閱文獻，與文獻報道菌株進行比較，確定其在分類學上地位[21]。</p><p><b>　　2.3 分子鑒定</b></p

36、><p>　　2.3.1 菌種培養(yǎng)</p><p>　　菌種來源菌種為實驗室從土壤中分離得到的產黑色素菌株。經過純化分離并做菌種斜面保藏。</p><p>　　活化選擇細菌培養(yǎng)基見表2-3。</p><p>　　表2-3 培養(yǎng)基的組成成分</p><p>　　在無菌條件下挑取單菌落，接種于上述液體培養(yǎng)基中，放置于28℃恒

37、溫搖床中培養(yǎng)過夜（約12h），再在無菌條件下轉接至滅過菌的培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)10h左右，做甘油管保藏備用。</p><p>　　2.3.2 基因組提取</p><p>　　實驗試劑配制[22-23]</p><p>　　溶菌酶(10mg/mL)：滅菌2.0mL Eppendorf管稱取0.01854g溶菌酶，加1855uL無菌水溶解，分裝待用；</p&

38、gt;<p>　　蛋白酶K(20mg/mL)：滅菌2.0ml Eppendorf管稱取0.03262g蛋白酶K，加1630uL無菌水溶解，分裝待用；</p><p>　　酚/氯仿/異戊醇25:24:1：按照體積比配制50mL備用；</p><p>　　醋酸鈉（pH4.6）：取無水醋酸鈉40.81g溶于80mL水中。將pH調至4.6將體積調至100mL，分裝并高壓滅菌；<

39、/p><p>　　10%SDS：在900mL水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用；</p><p>　　TE緩沖液（pH8.0）：10mM Tris·Cl（pH8.0），1 mM EDTA （pH8.0）；</p><p>　　70%乙醇溶液：無水乙醇與蒸餾水以7:3的 比例配制備用；

40、</p><p>　　實驗方法[24-27]</p><p><b>　　方法一</b></p><p>　　取1.5mL菌液，5000r/min離心10min，用TE洗滌后再離心，菌體重懸于1mL TE溶液。</p><p>　　加入50mg/mL 溶菌酶溶液2uL（終濃度100ug/mL），混勻，37℃保溫20-30

41、min。</p><p>　　加入RNAase（10mg/mL）10uL，至終濃度為25ug/mL，加入10%SDS 0.125mL，37℃下保溫30min。</p><p>　　加入蛋白酶K（20mg/mL）2.5uL，至終濃度為50ug/mL，然后在37℃下保溫60-90min。</p><p>　　加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）抽提一次（慢慢

42、旋轉混勻，傾斜使兩相接觸面積增大），4℃，8000r/min離心5min，取上清液轉入另一離心管中。</p><p><b>　　循環(huán)2-3次。</b></p><p>　　用擴口吸頭小心吸出含DNA的水相，加1/5體積的NaAc緩沖液，旋轉混勻，再向管中加入2倍體積的無水乙醇，小心混勻，沉淀DNA。</p><p>　　用70%乙醇洗滌一次，

43、室溫干燥，但勿使DNA完全干燥，以便溶解。</p><p>　　加入25uL TE緩沖液溶解DNA。</p><p><b>　　方法二</b></p><p>　　發(fā)酵液于室溫10000rPmin 離心5min 收集菌體,棄上清。</p><p>　　加入300μl 至500μl TE(1mmol/L Tris

44、3;Cl , 1mmol/L EDTA , pH8. 0) , 懸渦振蕩懸起沉淀并充分混勻反應液。</p><p>　　加入1/100 體積濃度10mg/ml 的溶菌酶,1/100 體積濃度20mg/ml 蛋白酶K 倒管并充混勻,37 ℃反應30min。</p><p>　　加入1/10 體積的10 % SDS 和0. 5 mol/L EDTA ,倒管充分混勻,55 ℃反應1h。</

45、p><p>　　加入2/3 體積7 mol/L 預冷乙酸銨溶液,倒管充分混勻,10000r/min 離心5min , 保留上清。</p><p>　　加入2 倍體積無水乙醇- 20 ℃醇沉30min ,12 000r/min離心5min ,小心棄上清。</p><p>　　加入70 %乙醇倒管洗沉淀2 次(1ml/次) ,12 000r/min離心5min ,小心棄上清

46、。</p><p>　　真空抽干沉淀并溶于50μl TE。</p><p><b>　　方法三</b></p><p>　　將分離的放線菌轉接到高氏1號液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7 d,取生長良好的放線菌菌液2 ml置于EP管中, 10 000 r/min離心8 min,棄上清,保留菌體。</p><p>　　破壁、蛋白質和核

47、酸分離:每個EP管加入TE溶液300μl,用槍頭吹吸3次充分混勻,10000r/min離心5 min,棄上清液,再加入20 mg/ml的溶菌酶溶液15μl,用槍頭充分混勻, 37 ℃水浴4 h; 每個EP管中加入20mg/ml蛋白酶K溶液8μl,再加入10% SDS溶液和0. 5mol/L的EDTA溶液各40μl,輕搖, 55 ℃水浴過夜。</p><p>　　抽提：加等體積的Tris 飽和酚,顛倒使之充分混勻,

48、 10 000 r/min離心8 min,取上清轉至另1支新的1. 5 ml EP管中,再加等體積24∶1的氯仿/異戊醇,充分混勻, 10 000 r/min離心8 min,取上清轉至另1支1. 5 ml EP管中。</p><p>　　沉淀：加等體積異丙醇, - 20 ℃沉淀30 min, 8 000 r/min離心5 min,棄上清保留沉淀。</p><p>　　洗滌：加70%乙醇洗滌

49、沉淀2次,每次洗滌后8 000r/min離心5 min,棄上清保留沉淀DNA。</p><p>　　洗脫：將EP管倒置于濾紙上,充分干燥后加TE溶液20μl,室溫放置15min, 4 ℃過夜使DNA充分溶解。</p><p>　　2.3.3 凝膠電泳</p><p>　　實驗試劑及儀器[22,23]</p><p>　　TAE緩沖液：0.0

50、4 M Tris-醋酸，0.002M EDTA（pH8.0）；</p><p>　　上樣緩沖液（緩沖液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中），基因組提取產物。</p><p>　　① 制備1.0%瓊脂糖凝膠(大膠用50mL,小膠用30mL)：稱取適量的瓊脂糖置于錐形瓶中，加入0.5×TBE緩沖液，微波爐加熱至瓊脂

51、糖全部融化，搖勻，待瓊脂糖凝膠冷卻至65℃左右時，加入一滴溴化乙錠，搖勻，配成1.0%瓊脂糖凝膠；取電泳槽內的有機玻璃內槽(制膠槽)洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板。將膠板槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。倒膠時要避免產生氣泡，若有氣泡可用吸管小心吸去。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內槽放入電泳槽中。

52、添加 1×TBE電泳緩沖液至沒過膠板為止。</p><p>　?、?加樣：混合DNA樣品和10x上樣緩沖液。用10 μL微量移液器分別將樣品加入點樣孔,每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。 ③ 電泳：加樣后的凝膠板，通電進行電泳,首先電壓100V，樣品由負極(黑色)向正極(紅色)方向移動，電泳5min，使DNA樣品進入凝膠內，后電壓降為80V，繼續(xù)電壓，當

53、溴酚藍移動到合適位置，停止電泳。 ④ 電泳完畢后，取出凝膠觀察照相。將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，打開314nm紫外燈觀察DNA樣品紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。</p><p>　　2.3.4 PCR擴增</p><p><b>　　實驗條件</b></p><p>　　根據(jù)對產黑色素菌株的生理生化及菌落進行的菌種鑒定，查閱《常

54、見細菌菌種鑒定手冊》[29]，確定這一菌株16S rRNA的保守序列為PCR 引物為16 ( + ) : 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAGA-</p><p>　　ACGAAC 3′，16 ( - ) :5′TACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCC 3′。委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成。</p><p>　　本實驗PCR擴增反應體系為20μL，反應

55、體系組成如表2-4：</p><p>　　表2-4 PCR反應體系</p><p>　　PCR 擴增條件:94℃預變性10 min，94℃變性1min，52℃退火1 min，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。</p><p>　　將PCR產物依上述瓊脂糖凝膠電泳進行擴增檢測。根據(jù)文獻報道，放線菌16S rRNA長度為1500bp，引物設計

56、獲得擴增序列長度約為1500bp，擴增得到的產物經純化后，進行序列測定。</p><p>　　2.3.5 切膠回收</p><p>　　通過瓊脂糖膠電泳盡可能將目的DNA片段與其它片段分開，用小刀將含目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊切下，放入1.5mL離心管中，稱重。</p><p>　　根據(jù)膠塊的重量和濃度，按每100mg瓊脂糖加300-600 uL的比例加入Buf

57、fer B2。</p><p>　　3. 將離心管至于50℃水浴5-10min，間或混勻，直至膠塊完全溶化。</p><p>　　4. 將溶化好的溶液全部移入吸附柱，8000×g 離心30s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。</p><p>　　5. 向吸附柱中加入500uL Wash Solution，9000×g 離心30s

58、，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。</p><p>　　6. 重復步驟5一次。</p><p>　　7. 將空吸附柱和收集管放入離心機，9000×g 離心1min。</p><p>　　8. 在吸附膜中加入15-40uL Elution Buffer，室溫靜止1-2min，9000×g 離心1min。將所得到的DNA溶液置于-2

59、0℃保存或用于后續(xù)試驗。</p><p>　　2.3.6 連接反應</p><p>　　本實驗連接反應體系為10μL，反應體系組成如表2-5：</p><p>　　表2-5 連接反應體系</p><p>　　16-23℃連接1-2 h。</p><p>　　2.3.7 感受態(tài)細胞的制備</p><

60、;p>　?、?接種一個單菌落于50mL LB培養(yǎng)液中，與37℃搖床培養(yǎng)過夜（250r/min），獲得一級種子；</p><p>　　② 轉接1mL一級種子至250mL的搖瓶中250r/min培養(yǎng)至OD600為0.4左右；</p><p>　?、?將培養(yǎng)液分裝到預冷無菌的聚丙酮管中，于冰上放置5-10min，然后于4℃，4000r/min離心；</p><p>

61、　　④ 細胞沉淀用10mL冰冷的CaCl2溶液重懸，于4℃，以4000r/min離心10min；</p><p>　?、?細胞沉淀用10mL冰冷的CaCl2溶液重懸，于4℃，以4000r/min離心5min；</p><p>　?、?用1mL冰冷的含有15%甘油的CaCl2重懸各管細胞，然后按每管100ul的量分裝于預冷的無菌聚丙酮管中，立即凍存于-70℃。</p><

62、p>　　2.3.8 轉化反應</p><p>　　1. 100uL感受態(tài)細胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮。</p><p>　　加入5uL連接液，輕輕混勻，冰上放置30min。</p><p>　　3. 42℃水浴熱激90s，冰上放置15-20min。</p><p>　　加400uL LB培養(yǎng)基，37℃ 200-250

63、rpm振蕩培養(yǎng)1h。</p><p>　　5. 室溫下4000rpm離心5min，用槍頭吸掉400uL上清液，用剩余的培養(yǎng)基將細胞懸浮。</p><p>　　6. 將細菌涂布在預先用20uL 100mM IPTG和100uL 20mg/mL X-gal涂布的氨芐青霉素平板上。</p><p>　　7. 平板在37℃下正向放置1h以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜

64、。</p><p><b>　　2.3.9 鑒定</b></p><p>　　挑取平板上的白色菌落于盛有抗生素的LB培養(yǎng)基的試管中37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)12h。</p><p>　　用培養(yǎng)液當做菌體模板進行PCR擴增。</p><p><b>　　瓊脂糖凝膠電泳。</b></p>

65、<p>　　2.3.10 質粒DNA的提取</p><p><b>　　實驗試劑配制</b></p><p>　　溶液Ｉ（pH8.0）：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Hcl，10mmol/LEDTA；</p><p>　　溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH和2%SDS用前等體積混合；</p>

66、<p>　　溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸鈉 60mL，冰醋酸 11.5mL，水 28.5mL；</p><p><b>　　質粒提取步驟</b></p><p>　　1. 先在3mL LB液體培養(yǎng)基中加入3uL 羧芐青霉素，然后接入一個含質粒的大腸桿菌單</p><p>　　菌落，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；</p><

67、p>　　2. 將過夜培養(yǎng)的菌液加入1.5mL小指管中，4000r/min離心1min，吸去培養(yǎng)液，將所有菌體細胞收集在一個小指管中；</p><p>　　3. 加入100uL溶液Ｉ于含菌體細胞的小指管中，漩渦震蕩將細菌沉淀懸浮，室溫放置10min；</p><p>　　4. 加入200uL溶液Ⅱ，輕輕混勻內容物，溶液逐漸變清亮后加入溶液Ⅲ；</p><p>　

68、　5. 加入150uL溶液Ⅲ，蓋緊管口，輕輕混勻數(shù)次。冰上放置15min讓質粒復性；</p><p>　　6. 12000r/min離心10min，將上清液轉至另一1.5mL小指管中；</p><p>　　7. 向上清中加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇，漩渦混勻，12000r/min離心5min，將上清轉移 到另一1.5mL小指管中；</p><p>　　8. 向

69、上清中加入等體積氯仿：異戊醇，漩渦混勻，12000r/min離心5min，將上清轉移到另一1.5mL小指管中；</p><p>　　9. 向上清中加入2倍體積無水乙醇，漩渦混勻后，室溫放置30min。12000r/min離心10min，吸去上清液；</p><p>　　用1mL70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀2次，吸去上清液；</p><p>　　加入30uLTE緩沖液

70、，使質粒DNA完全溶解，-20℃保存。</p><p><b>　　質粒的電泳檢測</b></p><p>　　采用瓊脂糖凝膠電泳分析，條件如下：瓊脂糖濃度1.0%，電泳電壓90V，電泳緩沖液TBE，采用UVP凝膠成像儀分析電泳結果。</p><p><b>　　3 結果與分析</b></p><p&

71、gt;　　3.1 菌落生理生化特性鑒定</p><p>　　經過平板培養(yǎng)，觀察菌落特征，該菌菌落的基本特征是菌落質地致密，表面呈緊密的絨狀，堅實干燥而多皺。經過制片鏡檢發(fā)現(xiàn)此菌初步判斷為放線菌（見圖3）。</p><p><b>　　圖3 菌株鏡檢照片</b></p><p>　　3.2 分子鑒定 </p><p>

72、　　3.2.1 基因組凝膠電泳圖譜</p><p>　　基因組提取瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖4。樣品及Marker點樣順序依次從左到右為基因組DNA提取物、Marker。</p><p>　　圖4 基因組提取電泳圖譜</p><p>　　從電泳的結果，可以看出，基因組DNA的提取成功且質量較高。</p><p>　　3.2.2 PCR擴增&

73、lt;/p><p>　　根據(jù)細菌16SrRNA的保守序列設計引物為：16 ( + ) : 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG AAC 3′，16 ( - ) : 5′TACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCC 3′。委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成。 </p><p>　　圖5 PCR擴增產物電泳圖譜</p><p>　　

74、將PCR產物依上述瓊脂糖凝膠電泳進行擴增檢測。根據(jù)資料，擴增序列約為1500bp。瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜如圖5。PCR擴增產物長度大約在1500bp，與預先設計引物時所期望得到的長度相一致。</p><p>　　3.2.3 轉化反應</p><p>　　在涂布有IPTG和X-gal的氨芐青霉素的平板上分別長有白色菌落和藍色菌落。白色菌落說明目的基因已經導入到了受體細胞，藍色菌落說明目的基

75、因沒有導入受體細胞。此次試驗的平板上長有大量的白色菌落和個別的藍色菌落，說明了目的基因的導入效果是比較好的。平板圖片見圖6。</p><p>　　圖6 藍白斑篩選的平板</p><p>　　3.2.4 導入后的PCR擴增</p><p>　　以導入后的菌液作為DNA模板進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖譜見圖7。</p><p&g

76、t;<b>　　圖7 電泳圖譜</b></p><p>　　3.2.5 質粒提取</p><p>　　質粒瓊脂糖凝膠電泳圖譜如下圖8所示。</p><p><b>　　1 2 </b></p><p><b>　　圖8 質粒電泳圖譜</b></p>&l

77、t;p>　　從電泳結果來看，樣品1質粒提取的濃度比樣品2高一些，所以擇優(yōu)選擇樣品1為待測樣品。</p><p>　　3.2.6 基因測序</p><p>　　基因測序委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行。測序所得結果并在ncbi網站GenBank中注冊如下：</p><p>　　GenBank flat file:</p><p>

78、;　　LOCUS BSeq#1 612 bp DNA linear 20-MAY-2011</p><p>　　DEFINITION WordPad</p><p>　　ACCESSION BSeq#1</p><p>　　VERSION </p><p>　　K

79、EYWORDS .</p><p>　　SOURCE nucleomorph WordPad </p><p>　　ORGANISM WordPad </p><p>　　Unclassified.</p><p>　　REFERENCE 1 (bases 1 to 612)</p>

80、;<p>　　AUTHORS LIU,X. and Tao,R.</p><p>　　TITLE Black pig-1 </p><p>　　JOURNAL Unpublished </p><p>　　REFERENCE 2 (bases 1 to 612)</p><p>　　AU

81、THORS LIU,X. and Tao,R.</p><p>　　TITLE Direct Submission</p><p>　　JOURNAL Submitted (20-MAY-2011) Bioengineering, Bioengineering, Er Huan

82、 west road, Jiaxing, Zhejiang 314001, China</p><p>　　COMMENT Bankit Comment: TOTAL # OF SEQS:1.</p><p>　　FEATURES Location/Qualifiers</p><p>　　source

83、 1..612 </p><p>　　/organism='WordPad' </p><p>　　/organelle='nucleomorph' </p><p>　　/mol_type='g

84、enomic DNA' </p><p>　　/PCR_primers='fwd_name: accaccacacactacac, fwd_seq:</p><p>　　gtgacacgtacagct, rev_name: caacccacagactacac, rev_seq:</p><p>　　atcg

85、cacgtacacgt' </p><p>　　BASE COUNT 125 a 194 c 156 g 137 t</p><p>　　ORIGIN </p><p>　　1 cagaccag

86、gt cttacggtta ccttgttacg acttcacccc aatcgccagt cccaccttcg </p><p>　　61 acagctccct cccacaaggg gttgggccac cggcttcggg tgttaccgac tttcgtgacg </p><p>　　121 tgacgggcgg tgtgtacaag gcccggga

87、ac gtattcaccg cagcaatgct gatctgcgat </p><p>　　181 tactagcaac tccgacttca tggggtcgag ttgcagaccc caatccgaac tgagaccggc </p><p>　　241 tttttgagat tcgctctacc tcacggtttc gcagctcatt gtaccggc

88、ca ttgtagcacg </p><p>　　301 tgtgcagccc aagacataag gggcatgatg acttgacgtc gtccccacct tcctccgagt </p><p>　　361 tgaccccggc ggtctcctgt gagtccccat caccccgaag ggcatgctgg caacacagga &l

89、t;/p><p>　　421 caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc </p><p>　　481 catgcaccac ctgtataccg accacaaggg gggcactatc tctaatgctt tccggtatat </p><p>　　5

90、41 gtcaagcctt ggtaaggttc ttcgcgttgc gtcgaattaa gccacatgct ccgctacttg </p><p>　　601 tgcgggcccc cg</p><p>　　本序列已在Genbank中注冊?；虮葘Y果顯示實驗室這一篩選菌株與文獻報道的產黑色素的棒狀鏈霉菌屬16SrRNA極高，相似度達到了98%。</p>

91、<p>　　3.2.7 構建進化樹</p><p>　　將得到的基因測序結果用在線的Blast軟件（http：// www. ncbi．nlm. nih．gov/blast ) 進行同源性分析，結果在GenBank中找到多個顯著相似的基因序列，其同源性高達98%。通過Blast P工具在NCBI蛋白質序列數(shù)據(jù)庫中進行同源性搜索，并利用Clustal W程序進行多重序列比對，利用MEGA4.0軟件，采

92、用相鄰連接方法(Neighbor Joining Method)，獲得該蛋白系統(tǒng)進化樹（圖9）。</p><p><b>　　圖9 系統(tǒng)進化樹</b></p><p><b>　　4 結論</b></p><p>　　本實驗主要是從土壤中分離得到一株產黑色素菌株，根據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢觀察初步鑒定為一株放線菌。后又采用16S

93、rRNA分子鑒定方法，通過序列對比發(fā)現(xiàn)其與鏈霉菌屬的相似度達到98%。但如需確定菌株的種還需進行詳盡的以及更深入的試驗和研究。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]Ruan L F，Shen P．Melanin Pigment Formation and Increased UV Resistance in Bacilus thur

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