天然色素生產(chǎn)菌的誘變選育[畢業(yè)設(shè)計(jì)]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　?。ǘ?屆）</b></p><p>　　天然色素生產(chǎn)菌的誘變選育</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專(zhuān)業(yè)班級(jí) 生物工程 </p&

2、gt;<p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱(chēng) </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要：在已誘變過(guò)的原始菌株中篩選出紅色素高產(chǎn)菌株，并將其作為出發(fā)菌株，采用微波—氯化鋰

3、復(fù)合誘變方法。結(jié)果通過(guò)微波—氯化鋰復(fù)合處理獲得一株高產(chǎn)菌株色素產(chǎn)量比原始菌株提高了5%，但經(jīng)4次傳代實(shí)驗(yàn)證明，突變高產(chǎn)菌株不具備遺傳穩(wěn)定的性質(zhì)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：紅色素；氯化鋰；誘變；微波</p><p>　　Abstract: The starting strain with high-yield natural red pigment was separated from

4、a mutant strain which was partly degenerated. In this experiment get a higher-yield natural red pigment through the composite mutation with microwave processing and licl. A high-yield mutant strain was obtained by compos

5、ite mutation with microwave processing and licl. The high-yield stain had genetic Stability by three times genetic trials, and the yield of red pigment was improved 5% than the control.But it has</p><p>　　Ke

6、ywords: red pigment;licl;mutation; microwave目 錄</p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1 選題的背景和意義1</p><p>　　1.2.誘變選育技術(shù)獲得高產(chǎn)色素生產(chǎn)菌株2</p><p>　　1.2.1 誘變選育定義2&l

7、t;/p><p>　　1.2.2 誘變劑的種類(lèi)和選擇2</p><p>　　1.2.3 誘變處理3</p><p>　　1.3誘變實(shí)例借鑒5</p><p>　　1.4誘變育種新技術(shù)6</p><p>　　1.4.1離子注入誘變技術(shù)6</p><p>　　1.4.2激光誘變育種6<

8、/p><p>　　1.4.3 空間誘變6</p><p>　　1.4.4其他新型誘變技術(shù)6</p><p>　　1.5 相關(guān)研究的最新成果及動(dòng)態(tài)7</p><p>　　1.6 實(shí)驗(yàn)的目的、內(nèi)容與難點(diǎn)7</p><p><b>　　2實(shí)驗(yàn)部分8</b></p><p>

9、;　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料8</p><p>　　2.1.1 菌種8</p><p>　　2.1.2 主要儀器與試劑8</p><p>　　2.1.3 培養(yǎng)基8</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法9</p><p>　　2.2.1 菌種的培養(yǎng)與活化9</p><p>　　2

10、.2.2 菌種的保藏9</p><p>　　2.2.3 菌種的純化9</p><p>　　2.2.4 優(yōu)良出發(fā)菌株的篩選9</p><p>　　2.2.5 微波氯化鋰復(fù)合誘變9</p><p>　　2.2.6 致死率的確定9</p><p>　　2.2.7 初篩10</p><

11、p>　　2.2.8 搖瓶培養(yǎng)及色素量的測(cè)定10</p><p>　　2.2.9 復(fù)篩10</p><p>　　2.2.10 穩(wěn)定性的確定10</p><p>　　2.2.11靈菌紅素吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定10</p><p>　　3 結(jié)果與分析11</p><p>　　3.1 優(yōu)良出發(fā)菌株的篩選1

12、1</p><p>　　3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定11</p><p>　　3.1.2 單個(gè)平板菌株的初篩11</p><p>　　3.1.3平板菌株的復(fù)篩12</p><p>　　3.1.4優(yōu)良菌株的穩(wěn)定性12</p><p>　　3.2 致死率與誘變劑量的關(guān)系13</p><p>

13、　　3.2.1 微波誘變機(jī)理13</p><p>　　3.2.2 照射時(shí)間和致死率關(guān)系13</p><p>　　3.2.3 致死率曲線(xiàn)13</p><p>　　3.3 高產(chǎn)菌株的初篩14</p><p>　　3.3.1 初篩14</p><p>　　3.3.2 一次復(fù)篩15</p>

14、<p>　　3.3.3 二次復(fù)篩16</p><p>　　3.4 高產(chǎn)株與對(duì)照株比較16</p><p>　　3.5 突變菌株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)17</p><p><b>　　4結(jié)論18</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)19</b></p><p&

15、gt;　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 選題的背景和意義</p><p>　　紅色素分為人工合成色素和天然色素兩大類(lèi)，由于合成色素的安全性問(wèn)題，不少合成色素在各國(guó)允許使用的程度被大大限制，尤其在食品、醫(yī)藥、和化妝品行業(yè)。隨著人們逐漸認(rèn)識(shí)到許多人工合成色素對(duì)人體極端有害

16、且人工合成紅色素對(duì)人體健康的危害越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn)，尤其是致癌、致畸、致突變、致敏已引起人們的高度重視[1]。因此，利用無(wú)毒害并有一定藥理作用的天然植物提取食和色素，這是當(dāng)今的新趨勢(shì)。</p><p>　　天然色素與人工合成色素相比有無(wú)毒、安全性高，色澤自然鮮艷、并有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理功能等優(yōu)越性，日益受到重視和青睞。開(kāi)發(fā)天然色素是世界應(yīng)用色素發(fā)展的總趨勢(shì)，很多天然色素具有安全可靠，沒(méi)有毒副作用，色調(diào)自然，接近天

17、然物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，天然、營(yíng)養(yǎng)、多功能是色素發(fā)展的趨勢(shì)。天然色素現(xiàn)在主要三從植物、動(dòng)物材料和微生物細(xì)胞中獲得。因動(dòng)植材料生長(zhǎng)繁殖受季節(jié)、氣候、產(chǎn)地等因素的影響，原料不足，從中提取的色素價(jià)格昂貴，應(yīng)用受到局限，而利用微生物資源生產(chǎn)天然色素，克服以動(dòng)植物為原料生產(chǎn)天然色素的諸多缺點(diǎn)，并且易于工業(yè)化。因此，采用微生物生產(chǎn)天然色素將逐步成為天然色素來(lái)源的主流 [2] 。</p><p>　　利用微生物資源，通過(guò)對(duì)環(huán)境友好的生物

18、法生產(chǎn)天然色素，不僅能克服以植物為原料生產(chǎn)天然色素，周期長(zhǎng)、提取復(fù)雜、原料不足、價(jià)格昂貴等諸多缺點(diǎn)，且易滿(mǎn)足規(guī)范化、標(biāo)隹化、連續(xù)化的工業(yè)化大生產(chǎn)需要。因此，采用微生物生產(chǎn)天然色素將會(huì)成為天然色素來(lái)源主要途徑?，F(xiàn)在人類(lèi)對(duì)于色素的需求不斷的增加，而化學(xué)合成色素遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿(mǎn)足人們的需求，同時(shí)化學(xué)合成存在著種種問(wèn)題，人們不斷的去追求新的方法，而從植物中提取也存在很多的問(wèn)題，人們把目標(biāo)轉(zhuǎn)移到了微生物中發(fā)酵產(chǎn)生人們所需的天然紅色素來(lái)滿(mǎn)足自己的需求。同

19、時(shí)微生物具備較好的優(yōu)點(diǎn)，解決化學(xué)合成和動(dòng)植物中提取的缺陷。隨著工業(yè)的發(fā)展，提取的方法不斷的改善，人們還是不滿(mǎn)足現(xiàn)在的現(xiàn)狀，微生物的產(chǎn)色素的量還是不夠，提取的完善，現(xiàn)階段通過(guò)改變微生物產(chǎn)紅色素的能力，提高產(chǎn)量來(lái)滿(mǎn)足色素的供應(yīng)。微生物產(chǎn)紅色素還不時(shí)很完美，同樣需要不斷的改進(jìn)[3]。</p><p>　　這次實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象是靈菌紅素。靈菌紅素族(Prodigiosins,PG)是一個(gè)天然紅色素家族的總稱(chēng)， 包括 Pro

20、digiosin , Prodi2giosin 25-C，Metacycloprodigiosin,Uncedylprodigiosin等，可以由多種放線(xiàn)菌和細(xì)菌產(chǎn)生。這一族色素通常都具有甲氧基吡咯的骨架結(jié)構(gòu)，具有一定的免疫抑制性質(zhì)。近年，研究人員的注意力都集中在由沙雷氏菌產(chǎn)生的靈菌紅素潛在的臨床應(yīng)用上面。靈菌紅素(Prodigiosin)是一種很有潛力的抗腫瘤藥物，靈菌紅素對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞DLD-1與 SW-620及人胃癌細(xì)胞株 HG

21、T-1的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其對(duì)這些腫瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所 (NSI) 證實(shí)靈菌紅素在平均 IC50為2.1μmol/L時(shí)對(duì)57種不同的人癌細(xì)胞有抗性作用，在相同的作用劑量下，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)任何毒害作用。</p><p>　　20世紀(jì)60年代早期，Rapoport等首先描述了PG化學(xué)合成的全過(guò)程，但比較復(fù)雜和困難。1996年D'Alessio等[4]提出了新的制備PG類(lèi)似物的方案，先將C環(huán)和B環(huán)相

22、連然后再和A環(huán)結(jié)合（以往模擬生物合成路線(xiàn)是先將B環(huán)和A環(huán)相連）即得PG前體物質(zhì)，步驟簡(jiǎn)單，合成效率明顯提高，但不能用來(lái)合成天然的十二烷基PG。Dairi等[5]利用市售商品4-methoxy-3-Pyrrotin-2-one經(jīng)兩步反應(yīng)得到了PG前體物質(zhì)4-methoxy-2,2-bipyrrole-5-carboxatdehyde,然后將不同的吡咯及其派生物與其相連接得到了不同的PG 類(lèi)似物。</p><p>　

23、　利用化學(xué)合成法大量制備PG一直未能實(shí)施，人們寄希望于微生物發(fā)酵生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)產(chǎn)PG微生物的研究主要集中在陸地微生物沙雷菌上。故非常有必要運(yùn)用誘變育種技術(shù)篩選出高產(chǎn)靈菌紅素的菌株。</p><p>　　1.2.誘變選育技術(shù)獲得高產(chǎn)色素生產(chǎn)菌株</p><p>　　1.2.1 誘變選育定義</p><p>　　誘變育種是指利用各種誘變劑的物理因素和化學(xué)因素處理微生

24、物細(xì)胞，提高基因突變頻率，再通過(guò)適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。誘變育種具有速度快、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前菌種選育的一種主要方法，使用普遍。誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變，所謂突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。</p><p>　　1.2.2 誘變劑的種類(lèi)和選擇</p><p>　　A.誘變劑種類(lèi)的選擇</p><p>　　物理

25、誘變劑包括：各種射線(xiàn)，如紫外線(xiàn)（焦耳）、X射線(xiàn)（庫(kù)侖/千克）、β射線(xiàn)、γ射線(xiàn)、α射線(xiàn)和超聲波等；化學(xué)誘變劑包括 甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍、亞硝酸、氮芥等。</p><p>　　選擇誘變劑要根據(jù)誘變劑作用機(jī)制，結(jié)合菌種特性來(lái)考慮選擇哪種誘變劑 ，同時(shí)要考慮菌種特性和遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)還要參考出發(fā)菌株原有的誘變系譜來(lái)選擇誘變劑。對(duì)遺傳穩(wěn)定的菌株，最好采用以前未使用過(guò)的、突變譜較寬的、誘變率高的強(qiáng)誘變劑進(jìn)行復(fù)合處

26、理，然后再采用一些作用較緩的誘變劑處理。對(duì)遺傳不穩(wěn)定的菌株，首先進(jìn)行自然分離，劃分菌落類(lèi)型，從中選擇效價(jià)高的、性能好的一類(lèi)菌落作為誘變處理的出發(fā)菌株。采用溫和誘變劑或?qū)υ擃?lèi)菌劑進(jìn)行繼續(xù)處理，從中篩選突變體。并結(jié)合自然分離和環(huán)境條件的改變，使有效的菌落類(lèi)型不斷增加，成為正常型菌落。在誘變之前還要考查出發(fā)菌株的誘變系譜，詳細(xì)分析，總結(jié)規(guī)律性，選擇一種最佳的誘變劑。 </p><p>　　B、最適誘變劑量的選擇 <

27、;/p><p>　　誘變的最適劑量，應(yīng)該使所希望得到的突變株在存活群體中占有最大比例，這樣可減少以后的篩選工作。 要確定一個(gè)合適的劑量，通常要經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)。就一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增高，但達(dá)到一定劑量后，再提高劑量會(huì)使誘變頻率下降。根據(jù)對(duì)紫外線(xiàn)、x 射線(xiàn)及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)正突變較多地出現(xiàn)在較低的劑量中。而負(fù)突變則較多地出現(xiàn)在高劑量中，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑

28、量更容易出現(xiàn)負(fù)突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向于采用較低劑量。例如，過(guò)去在用紫外線(xiàn)作誘變劑時(shí)，常采用殺菌率為90—99.9%的劑量，而近年來(lái)則傾向于采用殺菌率為70%～75%，甚至更低(30%～70%)的劑量，特別是對(duì)于經(jīng)多次誘變后的高產(chǎn)菌株更是如此[6]。</p><p>　　化學(xué)誘變劑主要是調(diào)節(jié)濃度、處理時(shí)間和處理?xiàng)l件（溫度、pH等）。物理誘變劑主要控制照射距離、時(shí)間和照射過(guò)程中的條件（氧、水等），以

29、達(dá)到最佳的誘變效果。 </p><p>　　1.2.3 誘變處理</p><p><b>　　不同誘變處理方法 </b></p><p>　?。?）紫外線(xiàn)照射 </p><p>　　紫外線(xiàn)誘變育種的原理是：紫外線(xiàn)是波長(zhǎng)短于紫色可見(jiàn)光而又緊接紫色光的射線(xiàn)、波長(zhǎng)范圍為136～300nm，紫外線(xiàn)波長(zhǎng)范圍雖寬，但有效范圍僅限于

30、一個(gè)小區(qū)域，多種微生物最敏感的波長(zhǎng)集中在265nm處，對(duì)應(yīng)于功率為15W的紫外燈。它是一種非電離輻射，當(dāng)物質(zhì)吸收一定能量的紫外線(xiàn)后，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發(fā)而造成突變；而不吸收紫外線(xiàn)的物質(zhì)，能量不發(fā)生轉(zhuǎn)移，分子也不會(huì)激發(fā)，不會(huì)產(chǎn)生任何化學(xué)變化，然而，脫氧核糖核酸能大量吸收紫外線(xiàn)，因此它極容易受紫外線(xiàn)的影響而變化。紫外線(xiàn)的誘變作用是由于它引起DNA分子結(jié)構(gòu)變化而造成的。這種變化包括DNA鏈的斷裂，DNA分子內(nèi)

31、和分子間的交連，核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，嘧啶水合物和嘧啶二聚體的產(chǎn)生等，特別是嘧啶二聚體的產(chǎn)生對(duì)于DNA的變化起主要作用。</p><p>　　不同的微生物對(duì)于紫外線(xiàn)的敏感程度不一樣，因此不同的微生物對(duì)于誘變所需要的劑量也不同。在紫外燈的功率、照射距離已定的情況下，決定照射劑量的只有照射時(shí)間，這樣可以設(shè)計(jì)一個(gè)照射不同時(shí)間梯度的實(shí)驗(yàn)，根據(jù)不同時(shí)間照射的死亡率，作出照射時(shí)間與死亡率的曲線(xiàn)，這樣就可以選擇適當(dāng)?shù)恼丈鋭┝俊?

32、</p><p>　　一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的劑量為最佳照射劑量，近來(lái)也有傾向于采用殺菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的劑量。一般認(rèn)為，偏低的劑量處理后正突變率較高，而用較高的劑量時(shí)則負(fù)突變率較高，但高劑量造成損傷大、回復(fù)少。目前趨向采用低劑量、長(zhǎng)時(shí)間處理，盡管致死率較高，而誘變效果較好。 </p><p><b>　　等離子輸入 <

33、/b></p><p>　　等離子輸入是一種較新的誘變方法，國(guó)外自20世紀(jì)60年代中、后期相繼開(kāi)始把等離子注入技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域的研究，國(guó)內(nèi)將離子束作為一種新技術(shù)應(yīng)用于生物等品種改良的研究則是由中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所于1986年開(kāi)創(chuàng)的。低能離子束是以具質(zhì)量、能量雙重誘變效應(yīng)的特征不同于傳統(tǒng)的電磁輻射，它的注入引發(fā)的生物效應(yīng)，機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，既有能量的沉積、動(dòng)量的傳遞，又有粒子的注入和電荷的交換，可導(dǎo)致

34、細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和膜電場(chǎng)的改良，與γ射線(xiàn)，中子束等明顯不同。離子束與生物體作用，首先有能量的沉積，即注入離子與生物大分子發(fā)生一系列碰撞，生物大分子獲得能量時(shí)，鍵斷裂，分子擊出原位，留下斷鍵或缺陷；同時(shí)還有質(zhì)量沉積，離子束是高LET粒子，有Braag峰，具有較強(qiáng)的電離作用，還能產(chǎn)生活性高的自由基間接損傷作用，因此它對(duì)生物體的作用可導(dǎo)致較高的突變率；另外由于注入離子的不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量、劑量的組合，提供了眾多的誘變條件，

35、通過(guò)這種電、能、質(zhì)的聯(lián)合作用，將強(qiáng)烈影響生物細(xì)胞的生理生化特性，以引起基因突變，所以變異幅度大，有較高的突變率，較廣的突變譜；再者突變體的遺傳性能比較穩(wěn)定，回復(fù)突變率低。 </p><p>　　（3）CO60 照射 </p><p>　　CO60屬γ射線(xiàn)，是一種高能電磁波，其誘發(fā)的突變率和射線(xiàn)劑量直接有關(guān)，而與時(shí)間長(zhǎng)短無(wú)關(guān)。它能產(chǎn)生電離作用，直接和間接改變DNA結(jié)構(gòu)。直接的效應(yīng)是導(dǎo)致堿

36、基的化學(xué)鍵、脫氧核糖的化學(xué)鍵、糖-磷酸相連接的化學(xué)鍵的斷裂；間接的效應(yīng)是電離輻射使水和有機(jī)分子產(chǎn)生自由基，自由基作用于DNA分子，特別是對(duì)嘧啶的作用更強(qiáng)，可引起缺失和損傷，造成基因突變，還能引起染色體斷裂，引起倒位、缺失和易位等畸變。不同的微生物對(duì)C060的輻射敏感程度差異很大，可以相差幾倍，引起最高變異的劑量也隨菌種而有所不同。</p><p>　　一般照射時(shí)多采用菌懸液，也可用長(zhǎng)了菌落的平皿直接照射。照射劑量

37、在4~10萬(wàn)倫琴，或者采用能使微生物產(chǎn)生90％~99％死亡率的劑量。電離幅射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺失突變，但可能影響鄰近基因的性能。 </p><p>　　B、不同誘變處理方式 </p><p>　　①單一因子處理：采用單一誘變劑處理，可以減少減少菌種遺傳背景復(fù)雜化、菌落類(lèi)型分化過(guò)多的弊病，使篩選工作趨向簡(jiǎn)單化。 </p><p>　

38、?、趶?fù)合因子處理：指兩種以上誘變因子共同誘發(fā)菌體突變。適合于遺傳性穩(wěn)定的純種及生活能力強(qiáng)的菌株處理，能導(dǎo)致較大的突變。主要有：兩個(gè)以上因子同時(shí)處理；不同誘變劑交替處理；同一種誘變劑連續(xù)重復(fù)使用；紫外線(xiàn)復(fù)活交替處理。 </p><p>　　1.3誘變實(shí)例借鑒 </p><p>　　目前誘變選育運(yùn)用較多的還是紫外線(xiàn)誘變由于紫外線(xiàn)不需要特殊貴重設(shè)備，只要普通的滅菌紫外燈管即能做到，而且誘變效果也

39、很顯著，因此被廣泛應(yīng)用于工業(yè)育種。</p><p>　　孫文紅,高玉榮在紫外誘變選育紅曲紅色素高產(chǎn)菌株的研究中運(yùn)用了紫外線(xiàn)照射并確定了合適的誘變劑量：2.5min為最佳誘變時(shí)間。[7] 王偉平,吳思方等在利用復(fù)合誘變紅曲霉選育紅色素高產(chǎn)菌株中同樣采用了紫外線(xiàn)—氯化鋰復(fù)合誘變技[8]這種方式為上訴提到的復(fù)合因子處理，是一種比較流行新興的誘變。</p><p>　　我國(guó)學(xué)者陶金莉等在選育高產(chǎn)靈

40、菌紅素沙雷氏菌株是運(yùn)用的是紫外線(xiàn)—氯化鋰復(fù)合誘變技術(shù)確定的紫外照射時(shí)間為20s。實(shí)驗(yàn)中在該照射時(shí)間下，添加氯化鋰發(fā)現(xiàn)對(duì)致死率沒(méi)有多大影響，但是正突變率有所提高[9-11]。</p><p>　　還有利用微波法選育紅曲霉菌種的，左秀鳳等人用50W的微波照射獲得高產(chǎn)菌株，研究了微波照射時(shí)間與正突變率，死亡率的關(guān)系，從而確定了適合的誘變劑量。[12]</p><p>　　此外有運(yùn)用離子注入的方法

41、來(lái)獲得誘變菌株：孫潔; 呂加平 等人利用N~+注入誘變高自溶度的乳酸菌突變株 ，誘變的效果也是非常好的。</p><p>　　誘變選育的例子舉不勝舉，但是從這些例子當(dāng)中可以總結(jié)出誘變選育的基本流程步驟和一些方法。</p><p>　　1.4誘變育種新技術(shù)</p><p>　　1.4.1離子注入誘變技術(shù)</p><p>　　離子注人對(duì)生物體的

42、誘變作用就是荷能離子束本身所具有的質(zhì)量、能量和電荷對(duì)生物體所產(chǎn)生 的直接作用。其中包括能量沉積、質(zhì)量沉積、電荷中和和交換、電子濺射、離子濺射等作用。同時(shí)，離子注入用于生物體誘變，可以在損傷輕的情況下獲得較高的突變率和較寬的突變譜[13.14]。 </p><p>　　1.4.2激光誘變育種 </p><p>　　激光誘變育種是20世紀(jì)70年代興起的一種誘變技術(shù)。國(guó)內(nèi)外利用激光誘變微生物已做

43、了不少 研究工作。激光誘變技術(shù)在微生物上應(yīng)用還是剛剛起步。但已取得了不少成績(jī)。并在此基礎(chǔ)上得出了一些規(guī)律性的認(rèn)識(shí)：其一 ，對(duì) 同一微生物而言，任何一個(gè)可見(jiàn)光波段都可以產(chǎn)生生物刺激作用：不同波長(zhǎng)的激光輻照微生物產(chǎn)生最大生長(zhǎng)刺激作用所需劑量不同：特定激光輻照微生物產(chǎn)生生長(zhǎng)刺激作用與該激光的輻照強(qiáng)度有密切關(guān)系。其二，對(duì)不同微生物而言。用同一波長(zhǎng)激光輻照產(chǎn)生 的生物效應(yīng)有較大差異。另外，激光誘變還受季節(jié)變化和細(xì)菌的生理狀態(tài)的影響。[15] &

44、lt;/p><p>　　1.4.3 空間誘變</p><p>　　空間誘變育種又稱(chēng)航天育種或太空育種。是指利用返回式衛(wèi)星、飛船或高空氣球?qū)⑸锊牧洗钶d到太空，利用太空特殊的環(huán)境( 空間宇宙射線(xiàn)、微重力、高真空、弱磁場(chǎng)等因素) 對(duì)生物材料進(jìn)行誘變，再返回地面選育新種質(zhì)、新材料，培育新品種的生物育種新技術(shù)?？臻g環(huán)境的主要特征是空間輻射、微重力、超真空和超凈環(huán)境等。</p><p

45、>　　1.4.4其他新型誘變技術(shù)</p><p>　　近些年，隨著人們對(duì)育種技術(shù)的不斷探索和追求。有許多新的育種技術(shù)相繼應(yīng)用于實(shí)踐。除前面闡述的空間誘變、離子束誘變和激光誘變外，還有微波、雙向復(fù)合磁場(chǎng)、紅外射線(xiàn)和高能電子流等新誘變技術(shù)相繼應(yīng)用于微生物育種中。其中高能電子流是較強(qiáng)的電離輻射，是抗生素生產(chǎn)中常采用的誘變?cè)催@些誘變?cè)磫为?dú)對(duì)微生物進(jìn)行誘變時(shí)效果不甚理想。但與其它誘變?cè)催M(jìn)行復(fù)合誘變。則能起到很好的誘變

46、效果，因此從某種意義上稱(chēng)這些誘變?cè)礊椤霸鲎儎薄?</p><p>　　此外 ，離子束微生物誘變育種多用的是 N+ 。今后應(yīng)加強(qiáng)其它離子應(yīng)用的研究相信隨著相關(guān)研究的深入。這些新型物理誘變技術(shù)必將在工業(yè)微生物誘變育種過(guò)程中選育出更多的優(yōu)良菌株，探索新的誘變技術(shù)的研究將具有廣闊的發(fā)展前景。[16]</p><p>　　1.5 相關(guān)研究的最新成果及動(dòng)態(tài) </p><p>

47、　　王學(xué)東[17]對(duì)野生黏質(zhì)沙雷菌株進(jìn)行紫外誘變處理，篩選獲得的鏈霉素抗性菌株搖瓶產(chǎn)量達(dá)到120 mg/L，發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)160 mg/L。</p><p>　　Tao 等[18]紫外誘變獲得了一株沙雷菌株B6，以葡萄糖為初始碳源，流加甘油為PG 合成誘導(dǎo)物，所開(kāi)發(fā)的流加發(fā)酵工藝不僅可防止菌體過(guò)早自溶，而且可部分消除PG 產(chǎn)物的抑制作用，將PG的合成能力提高了7.8倍，達(dá)583mg/L。</p>&l

48、t;p>　　Wei 等[19，20]以改進(jìn)LB培養(yǎng)基（MLB，提高胰蛋白胨和酵母膏的濃度并去除了NaCl）發(fā)酵沙雷菌生產(chǎn)PG，約比LB 增產(chǎn)3倍，達(dá)152mg/L；在培養(yǎng)基中添加2%~6% 的植物油，如豆油、棕櫚油、葵花子油等可促進(jìn)PG 的合成，最高達(dá)790mg/L，表明PG合成與胞外生物表面活性劑的存在有關(guān)。在YE培養(yǎng)基中添加含吡咯環(huán)的脯氨酸、組氨酸和天冬氨酸可顯著促進(jìn)UP的合成。當(dāng)添加10g/L 的脯氨酸時(shí)，產(chǎn)量可達(dá)2.5g/

49、L。</p><p>　　Cang 等[121]從土壤中分離獲得一株沙雷菌 S389，以乙醇為唯一碳源，PG 產(chǎn)量最高可達(dá)2.95 g/L。</p><p>　　Giri等[22]在黏質(zhì)沙雷菌的培養(yǎng)基中分別添加花生籽粉、芝麻粉、咖啡粉，均能顯著增加 P G 產(chǎn)量，其中以添加花生籽粉最為顯著，達(dá)到 38.75 g/L。</p><p>　　1.6 實(shí)驗(yàn)的目的、內(nèi)容與

50、難點(diǎn)</p><p>　　本課題所要研究探討的是通過(guò)生物誘變出高產(chǎn)紅色素的菌株，確定誘變條件，并從中篩選出高產(chǎn)的菌株，對(duì)高產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)條件的確定。利用各種化學(xué)和物理的方法，對(duì)產(chǎn)天然紅色素菌株進(jìn)行誘變，挑取顏色較深的菌落進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定誘變后的菌株的紅色素產(chǎn)量，同時(shí)優(yōu)化其培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)在于盡管現(xiàn)在關(guān)于誘變的方法較多，但具體什么方法適合天然紅色素菌株誘變，誘變的條件不確定，同時(shí)誘變的方向不確定，使得誘變的工作量比

51、較大，增加了實(shí)驗(yàn)的難度；誘變后菌株紅色素測(cè)定工作量大，同時(shí)突變菌株穩(wěn)定性測(cè)定易受其他條件的影響。</p><p><b>　　2實(shí)驗(yàn)部分</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p><b>　　2.1.1 菌種</b></p><p>　　

52、沙雷氏菌(Serratia jx1)，從土壤中篩選。</p><p>　　2.1.2 主要儀器與試劑</p><p><b>　　表1 實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用丙酮、氯化鈉、硫酸鎂、甘油、氯化鋰均為分析純、PN5247蛋白胨購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。</p><p>　　2.1.3

53、 培養(yǎng)基</p><p>　　固體培養(yǎng)基（g/L）：甘油2.0，蛋白胨13.0，NaCl 5.0，MgSO4 1.2，瓊脂20，pH 7.4-7.6。</p><p>　　發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L)： 蛋白胨13.0，甘油20.0，MgSO4 1.2，NaCl 5.0，搖瓶裝液量20mL/100mL(V/V)，接種量5％(V/V)，pH 5.7。</p><p>　

54、　優(yōu)化過(guò)的培養(yǎng)基（g/L）: 蛋白胨16.0，甘油20.0，MgSO4 1.2，NaCl 2.0，Gly 0.75，搖瓶裝液量20mL/100mL(V/V)，接種量5％(V/V)，pH 5.7。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 菌種的培養(yǎng)與活化</p><p>　　種子培養(yǎng)基的配制：按照

55、種子培養(yǎng)基的組成稱(chēng)取甘油2.0g，蛋白胨13.0g，Nacl 5.0g，瓊脂20g，MgSO4 1.2g，放到1000ml的燒杯中加水至1000ml，加熱攪拌溶解，用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，使其在7.4-7.6。然后分裝在250ml的搖瓶中，用滅菌鍋在121℃下滅菌20min，最后再倒平板[12]。待平板冷卻后在無(wú)菌條件下，用接種針挑取甘油管中的菌種劃平板，放在生化培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)12h，即得到

56、活化的沙雷氏菌，將其放于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.2.2 菌種的保藏</p><p>　　在無(wú)菌的條件下，從培養(yǎng)皿上挑取以活化的單個(gè)菌落，接種在種子培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)12h，得到活性好的菌株，作成甘油管，于-70℃冰箱里保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.2.3 菌種的純化</p><p>　　在無(wú)菌的條件下，將活化過(guò)

57、的菌株用接種環(huán)挑取在固體培養(yǎng)基上劃平板，活化得到單菌落，選擇生長(zhǎng)較快，紅色較深的菌株。</p><p>　　2.2.4 優(yōu)良出發(fā)菌株的篩選</p><p>　　用接種針挑取-70℃冰箱里保存的8只甘油管中的菌種分別劃平板，放在生化培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)12h，即得到活化的沙雷氏菌。之后從每個(gè)平板中挑取幾株大且紅的菌落進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)測(cè)其吸光度，通過(guò)比較它們的吸光度篩選出相對(duì)高產(chǎn)性狀穩(wěn)定的菌株。當(dāng)

58、8個(gè)平板都各自篩選出高產(chǎn)的菌株后，再將這8個(gè)菌株做次發(fā)酵，比較它們的吸光度，最后挑選出相對(duì)高產(chǎn)的菌株。</p><p>　　2.2.5 微波氯化鋰復(fù)合誘變</p><p>　　無(wú)菌條件下挑取自然選育得到的菌株放于盛有無(wú)菌生理鹽水(含0.12mol/L氯化鋰)及含有玻璃珠的三角瓶中，振蕩1h制得單細(xì)胞懸液。取5mL菌懸液于無(wú)菌試管中，置于50ml小錐形瓶中并加入50ml冰水后放在家用微波爐

59、正中央選用低檔微波照射，分別照射時(shí)間20s，40s，60s，80s，100s,120s后進(jìn)行稀釋涂布28℃培養(yǎng)24h后計(jì)算致死率，計(jì)算致死率，做出致死曲線(xiàn)，確定誘變條件。</p><p>　　2.2.6 致死率的確定</p><p>　　取誘變后的菌懸液1mL加入到4mL的生理鹽水溶液中，依此操作逐級(jí)稀釋至10-2，10-3，10-4，10-5倍。分別將上述誘變后的菌液按此方法稀釋后，取

60、各梯度的稀釋液100μL涂布在平板上，28℃培養(yǎng)24h，取生長(zhǎng)后菌落數(shù)約在30-80個(gè)的平板來(lái)記錄菌落數(shù)量，以未誘變的作為對(duì)照，計(jì)算致死率。</p><p><b>　　2.2.7 初篩</b></p><p>　　比較各誘變方法后，選出經(jīng)微波誘變照射時(shí)間80s時(shí)正突變幾率比較大，涂布培養(yǎng)的菌株生長(zhǎng)最快最紅。選取平板上長(zhǎng)勢(shì)較好的12株菌株搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)篩后測(cè)定紅色素

61、產(chǎn)量。</p><p>　　2.2.8 搖瓶培養(yǎng)及色素量的測(cè)定</p><p>　　篩選出來(lái)的菌株在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48h(100mL搖瓶裝液20mL，28℃，200r/min)。將發(fā)酵液取1ml離心后去除上清液，后加入1ml丙酮（pH約等于3）色素全部溶解后離心，得到色素提取液。在535nm下利用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。最后利用色素—吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出對(duì)應(yīng)的色

62、素含量。</p><p><b>　　2.2.9 復(fù)篩</b></p><p>　　選初篩后紅色素產(chǎn)量較高的6株進(jìn)行再次搖瓶復(fù)篩，如此篩選最終確定一株產(chǎn)量最高的進(jìn)行傳代培養(yǎng)，確定其穩(wěn)定性。</p><p>　　2.2.10 穩(wěn)定性的確定</p><p>　　挑取誘變后紅色且顏色較深單菌落傳代3次，每次選取產(chǎn)紅色素穩(wěn)定

63、株涂布于復(fù)篩培養(yǎng)基平板上，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)48h測(cè)定誘變菌株的活性來(lái)判定菌株的穩(wěn)定性。</p><p>　　2.2.11靈菌紅素吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定</p><p>　　稱(chēng)取少量靈菌紅素固體，用丙酮溶解后抽濾，去除不溶物后自然干燥至質(zhì)量不變，制得靈菌紅素粗品（下稱(chēng)粗品）。用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)量0.0200g粗品，定容至25ml制成0.8g/L母液，分別用移液槍吸取150ul，200ul，250ul，

64、300ul，350ul母液于比色管中并用丙酮定容至10ml制成0.012g/L，0.016 g/L，0.020 g/L，0.024 g/L，0.028 g/L溶液，分別測(cè)量其吸光度值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)平行五次。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 優(yōu)良出發(fā)菌株的篩選</p><p>　　3.1.

65、1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定</p><p>　　標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如下圖1所示：</p><p>　　圖1 靈菌紅素（丙酮）吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)</p><p>　　3.1.2 單個(gè)平板菌株的初篩</p><p>　　從8個(gè)保藏的甘油管中菌種分別劃平進(jìn)行活化，再?gòu)拿總€(gè)平板挑選幾株比較紅且大的菌落，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)及色素量的測(cè)定，比較后篩選出高產(chǎn)菌株。篩選期間的數(shù)據(jù)如下：&

66、lt;/p><p><b>　　表2初篩的吸光度</b></p><p>　　3.1.3平板菌株的復(fù)篩</p><p>　　根據(jù)上表可以篩選出8株相對(duì)優(yōu)良的菌株：①_2、②_6、③_3、④_6、⑤_7、⑥_4、⑦_(dá)1、⑧_8，將這8株菌株搖床培養(yǎng)同樣測(cè)各自的吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算出對(duì)應(yīng)的色素產(chǎn)量（g/L）。</p><p&g

67、t;　　吸光度結(jié)果如下表3：</p><p>　　表3 8株篩選出的菌株吸光度</p><p>　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算得到各自對(duì)應(yīng)的色素產(chǎn)量（g/L）如下圖2：</p><p>　　圖2 初篩得到的8株菌株色素產(chǎn)量</p><p>　　3.1.4優(yōu)良菌株的穩(wěn)定性</p><p>　　根據(jù)上圖得到⑥_4為優(yōu)良菌株，將其進(jìn)

68、行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，在平板傳代3代后進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)及色素量的測(cè)定做3組重復(fù)試驗(yàn)。經(jīng)測(cè)定該篩選出來(lái)的菌株具有相對(duì)較高的穩(wěn)定性，將其用甘油管保藏做為下面誘變實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。</p><p>　　表4出發(fā)菌株的穩(wěn)定性</p><p>　　第一代⑥_4的色素產(chǎn)量由上面的初篩的結(jié)果可算出為4.24g/L,說(shuō)明篩選得到的出發(fā)菌株⑥_4具有相對(duì)的穩(wěn)定性。</p><p>　　3.2

69、 致死率與誘變劑量的關(guān)系</p><p>　　3.2.1 微波誘變機(jī)理</p><p>　　微波是一種電磁波，能引起水、蛋白質(zhì)、核苷酸、脂肪和碳水化合物等極性分子轉(zhuǎn)動(dòng)，尤其是水分子在2450 MHz微波作用下，能在1S內(nèi)180℃來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)2.64×109次，從而引起分子間強(qiáng)烈的摩擦，使得胞內(nèi)DNA分子氫鍵和堿基堆積化學(xué)力受損，最終引起DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致遺傳變異。因此微波

70、誘變育種成為可能。</p><p>　　3.2.2 照射時(shí)間和致死率關(guān)系</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用微波—氯化鋰復(fù)合處理，并利用冰水降低其熱效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)采用照射時(shí)間，分別為20S、40S、60S、80S、100S、120S進(jìn)行致死率的研究。誘變的照射時(shí)間和致死率關(guān)系如下</p><p>　　表5 誘變的照射時(shí)間和致死率關(guān)系</p><p&g

71、t;　　3.2.3 致死率曲線(xiàn)</p><p>　　根據(jù)上表做出的致死率曲線(xiàn)如下圖</p><p><b>　　圖3 致死率曲線(xiàn)</b></p><p>　　根據(jù)近年來(lái)誘變劑量?jī)A向于采用殺菌率為70%～75%，甚至更低(30%～70%)的劑量，特別是對(duì)于經(jīng)多次誘變后的高產(chǎn)菌株更是如此[6] 。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)照射80S產(chǎn)生正突變的可能性較高，因此

72、實(shí)驗(yàn)采用照射80S進(jìn)行微波照射誘變。</p><p>　　3.3 高產(chǎn)菌株的初篩</p><p><b>　　3.3.1 初篩</b></p><p>　　經(jīng)過(guò)誘變后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)微波照射80S后的菌株生長(zhǎng)較快，從該平板上感官篩選出顏色深的菌落大的菌株，于平板上活化后進(jìn)行搖瓶產(chǎn)量初篩。從微波誘變80S平板中挑取長(zhǎng)勢(shì)較好且顏色較深的12株単菌落于平

73、板上活化后做搖瓶，培養(yǎng)48小時(shí)后分別測(cè)其吸光度，結(jié)果如下：</p><p>　　表6 微波80s初篩</p><p>　　圖4 對(duì)應(yīng)的色素含量</p><p>　　3.3.2 一次復(fù)篩 </p><p>　　根據(jù)上圖初篩結(jié)果挑取總色價(jià)較高的6株，即編號(hào)1、2、3、5、7、8，分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)48小時(shí)后測(cè)其吸光度值，結(jié)果如下：</p

74、><p>　　表7 微波80s一次復(fù)篩</p><p>　　圖5 第一次復(fù)篩色素含量</p><p>　　3.3.3 二次復(fù)篩</p><p>　　根據(jù)復(fù)篩結(jié)果挑取總色價(jià)較高的3株，即1、2、7號(hào)，分別進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)48小時(shí)后測(cè)吸光度值，結(jié)果如下：</p><p>　　表8 微波80s二次復(fù)篩</p><

75、;p>　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出1號(hào)產(chǎn)量最高，從而研究其穩(wěn)定性。</p><p>　　3.4 高產(chǎn)株與對(duì)照株比較</p><p>　　取1號(hào)搖瓶的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)做3組重復(fù)，測(cè)出吸光度值，并和未誘變的原始菌株進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)誘變后的菌株產(chǎn)紅色素的量是出發(fā)菌株的1.06倍，吸光度值如下</p><p>　　表9高產(chǎn)株與對(duì)照株的比較</p><p&g

76、t;　　3.5 突變菌株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)</p><p>　　將篩選出來(lái)的1號(hào)突變菌株通過(guò)4次傳代之后，測(cè)定其色素吸光度值并與原始對(duì)照菌株做比較看其色素產(chǎn)量與原始菌株的差別，從表10我們可以推測(cè)，此突變菌株穩(wěn)定較差。</p><p>　　表10 突變菌株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)</p><p><b>　　4結(jié)論</b></p><p>

77、;　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討，確定最佳的誘變條件，讓誘變產(chǎn)生正向突變的幾率變大。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，微波誘變的方法是一種較好的誘變方法。通過(guò)微波復(fù)合氯化鋰誘變天然紅色素產(chǎn)生菌，并得到高產(chǎn)紅色素的穩(wěn)定性好的突變菌株是可行的。通過(guò)微波誘變產(chǎn)生12株高產(chǎn)紅色素的菌株，經(jīng)過(guò)高產(chǎn)菌株的復(fù)篩，選取1株生長(zhǎng)較快的，顏色較深的穩(wěn)定性好的突變菌株。其中誘變最好的突變菌株的產(chǎn)量是出發(fā)菌株的1.06倍，誘變后的突變菌株的產(chǎn)量沒(méi)有明顯的提高，且經(jīng)4代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)篩選

78、出的突變菌株不具備遺傳穩(wěn)定的性質(zhì)。由于時(shí)間問(wèn)題不能進(jìn)行更多次的誘變實(shí)驗(yàn)，雖然這次誘變的結(jié)果不怎么樂(lè)觀但是通過(guò)這段時(shí)間的實(shí)踐使我掌握了更多的誘變相關(guān)的知識(shí)與實(shí)驗(yàn)操作技能。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1]岳靜,方宏筠,黃紅光.紫甘薯紅色素的研究進(jìn)展[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué).2003(5):22-25</p><p

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