不同來(lái)源sod性質(zhì)比較[畢業(yè)設(shè)計(jì)]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</p><p><b>　　（二零 屆）</b></p><p>　　不同來(lái)源SOD性質(zhì)比較</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 生物工程 </p&g

2、t;<p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要：超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱 SOD)作為生物體

3、內(nèi)重要的自由基清除劑，可以清除體內(nèi)多余的超氧陰離子，在防御生物體氧化損傷方面起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)主要從大腸桿菌中分離純化其發(fā)酵產(chǎn)生的SOD，同時(shí)采用兩次丙酮沉淀法和熱處理工藝提純豬血SOD，并通過鄰苯三酚法測(cè)定其活性，最后用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)其蛋白濃度，得到比活為8154U/mg的SOD蛋白。二者在耐熱性、熱穩(wěn)定性等方面有不同的性質(zhì)。</p><p>　　關(guān)鍵詞： 超氧化物歧化酶；鄰苯三酚法；分離純化</p&g

4、t;<p>　　不同來(lái)源SOD性質(zhì)的比較</p><p>　　Abstract: Superoxide dismutase (SOD) acts as a free radical scavenger in a living organism. It can remove extra superoxide anion in human body, so that plays an important

5、 role in defending oxidative damage. In this study we purified the recombinant SOD expressed in E.coil.At zhe same time, acetone precipitation and heat treatment process are used to purification SOD.The specific activity

6、 of the final product was 8154U/mg, which was determined by activity test and protein concentration measuremen</p><p>　　Keywords: Superoxide dismutase；pyrogallic acid；purification </p><p><

7、b>　　目 錄</b></p><p>　　中文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．（Ⅰ）</p><p>　　英文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．

8、．．（Ⅱ）</p><p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　1.1 超氧化物歧化酶的概況1</p><p>　　1.2 超氧化物歧化酶的分類及其分布1</p><p>　　1.3 SOD的作用機(jī)理2</p><p>　　1.4 SOD產(chǎn)品研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景2

9、</p><p>　　1.5 SOD分離提純的幾種主要方法3</p><p>　　1.6 本實(shí)驗(yàn)所采用的SOD提純方法概述3</p><p>　　2.1 材料與試劑4</p><p>　　2.1.1 材料4</p><p>　　2.1.2 試劑4</p><p>　　2.2

10、 實(shí)驗(yàn)儀器4</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)方法4</p><p>　　2.3.1 微生物細(xì)胞中提取SOD4</p><p>　　2.3.1 粗酶液的制備4</p><p>　　2.3.1.2 粗酶液的熱變性處理5</p><p>　　2.3.1.3 PEG-20000濃縮SOD5</p>

11、<p>　　2.3.1.4 SepHadex G-100分子篩純化SOD5</p><p>　　2.3.1.5 SOD活性的測(cè)定7</p><p>　　2.3.1.6 SOD酶液濃度的測(cè)定8</p><p>　　2.3.1.7 聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）8</p><p>　　2.3.1.8 微生物SO

12、D分離純化的工藝流程圖10</p><p>　　2.3.1.9 SOD最適溫度和熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)10</p><p>　　2.3.2 豬血中提取SOD12</p><p>　　2.3.2.1 分離紅血球:12</p><p>　　2.3.2.2 洗滌紅血球12</p><p>　　2.3.2.3 溶解破碎血細(xì)

13、胞12</p><p>　　2.3.2.4 萃取12</p><p>　　2.3.2.5 第一次丙酮沉淀12</p><p>　　2.3.2.6 熱處理12</p><p>　　2.3.2.7二次丙酮沉淀13</p><p>　　2.3.2.8 豬血SOD分離純化的工藝流程圖13</p>&

14、lt;p>　　2.3.2.9 豬血中SOD活性的測(cè)定14</p><p>　　2.3.2.10 豬血中SOD酶液濃度的測(cè)定14</p><p>　　2.3.2.11 豬血中SOD熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)14</p><p>　　2.3.2.12 pH值對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)14</p><p>　　3.1 基因工程菌SOD的各種性質(zhì)15

15、</p><p>　　3.1.1 PEG-20000濃縮SOD15</p><p>　　3.1.2 SepHadex G-100分子篩純化SOD15</p><p>　　3.1.3 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定SOD酶液蛋白濃度結(jié)果15</p><p>　　3.1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果16</p>

16、<p>　　3.1.5 基因工程菌SOD熱穩(wěn)定性試驗(yàn)17</p><p>　　3.1.6 pH值對(duì)酶活性的影響試驗(yàn)18</p><p>　　3.2 豬血中SOD的各種性質(zhì)18</p><p>　　3.2.1 樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果18</p><p>　　3.2.2 豬血SOD熱穩(wěn)定性試驗(yàn)19</p>

17、<p>　　3.2.3 pH值對(duì)酶活性的影響試驗(yàn)19</p><p>　　3.3基因工程菌SOD及豬血SOD性質(zhì)比較20</p><p>　　3.3.1 在酶活方面用鄰苯三酚法測(cè)定留樣的酶活20</p><p>　　3.3.2 在最適溫度方面20</p><p>　　3.3.3 在熱穩(wěn)定性方面21</p>

18、;<p>　　3.3.4 在最適pH方面21</p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)24</b></p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　1.1 超氧化物歧化酶的概況</p><p

19、>　　氧的某些代謝產(chǎn)物及其衍生的含氧物質(zhì)都是直接或間接由氧轉(zhuǎn)化而成的[1]。由于它們都含有氧，而且具有較活潑的化學(xué)反應(yīng)特性，遂統(tǒng)稱為活性氧（Active oxygen species，AOS），AOS包括超氧根離子（O2-）、氫氧根離子（OH-）、羥自由基（·O2）、過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）和過氧化物自由基（ROO-）。它們可導(dǎo)致膜脂過氧化、堿基突變、DNA鏈斷裂和蛋白質(zhì)的損傷等。植物體再正常生長(zhǎng)條件下也

20、能產(chǎn)生少量的O2-，它主要來(lái)源于線粒體的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、光合作用，以及一些氧化還原酶的產(chǎn)物。但再正常生理情況下，活性氧在不斷產(chǎn)生，也不斷被清除，因而不會(huì)造成自由基對(duì)機(jī)體的損傷[2]。</p><p>　　SOD是一種具有特定生物催化功能的蛋白質(zhì)，由蛋白質(zhì)和金屬離子組成 ，它廣泛存在于自然界的動(dòng)物、植物以及一些微生物的體內(nèi)。1938年Mann和Keilin首次從牛血紅細(xì)胞中得到了一種含銅蛋白，1969年Mc Cord

21、和Fridovich發(fā)現(xiàn)此蛋白能夠使超氧陰離子自由基O2-發(fā)生歧化反應(yīng)，因而將其定名為超氧化物歧化酶。</p><p>　　1.2 超氧化物歧化酶的分類及其分布</p><p>　　按金屬輔基成分的不同可分成3種類型[3]。最常見的一種含有銅鋅金屬輔基 (CuZn-SOD)，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在高等植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi)以及線粒體膜間隙也有存在，CuZn-SOD酶蛋白的分

22、子量約為3.2×104，純品呈藍(lán)綠色，每個(gè)酶分子由2 個(gè)亞基通過非共價(jià)鍵的疏水基相互作用締合成二聚體。每個(gè)亞基(肽鏈)含有銅、鋅原子各一個(gè)，活性中心的核心是銅。第二種含有錳離子(Mn-SOD)，主要存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞中，在植物的葉綠體基質(zhì)和類囊體膜上也有存在，純品呈粉紅色，由4條或2條肽鏈組成。第三種是Fe-SOD，過去一直認(rèn)為只存在于原核細(xì)胞中，近來(lái)發(fā)現(xiàn)有一些真核藻類甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD純品

23、呈黃色或黃褐色，由2條肽鏈組成，多數(shù)情況下每一個(gè)二聚體中含有一個(gè)Fe原子。</p><p>　　90年代，人們又陸續(xù)從鏈霉菌屬中發(fā)現(xiàn)了Ni-SOD和Fe·Zn-SOD，在牛肝中發(fā)現(xiàn)了一種Co·Zn-SOD等不同的SOD，這些都是少見的SOD[4]。</p><p>　　1.3 SOD的作用機(jī)理</p><p>　　生存環(huán)境的變化是不可避免的,

24、任何生物必須去適應(yīng)各種變化。以植物為例，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同條件、不同物種、不同的發(fā)育時(shí)期及不同器官發(fā)生脅迫后，SOD活性表現(xiàn)有升有降。然而SOD活性不論是升高還是降低，都表現(xiàn)出抗性強(qiáng)的品種比抗性弱的品種活性高。即當(dāng)SOD活性降低時(shí)，抗性強(qiáng)的品種下降幅度小；當(dāng)SOD活性升高時(shí)，抗性強(qiáng)的品種升高幅度大；或者抗逆性強(qiáng)的品種活性升高而抗逆性弱的品種降低。這說明在逆境條件下植物的抗性強(qiáng)弱與植物體內(nèi)能否維持較高的SOD活性水平有關(guān)[5] [6]。&l

25、t;/p><p>　　SOD的作用底物是生物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基O2-，作用機(jī)理是：</p><p>　　SOD+ O2- SOD-+O2</p><p>　　SOD-+O2 SOD+H2O2</p><p>　　總反應(yīng)：2O2-+2H+

26、 O2 + H2O2</p><p>　　之后H2O2被抗壞血酸和過氧化氫酶（前者是主要的）分解為H2O2和O2，從而解除O2-所造成的氧化脅迫[7]。</p><p>　　1.4 SOD產(chǎn)品研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景</p><p>　　SOD在食品當(dāng)中得到了廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)已開發(fā)出來(lái)很多富含SOD的食品，如SOD草莓、SOD啤酒、SOD蘋果、SOD桃子、SOD綠豆

27、芽、SOD活性茶以及SOD橙等，營(yíng)養(yǎng)豐富，市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益很好，有很好的發(fā)展?jié)摿Α?lt;/p><p>　　另外SOD無(wú)論是劑型、用藥途徑還是臨床應(yīng)用范圍都是相當(dāng)廣泛的，是一種具有廣闊前景的蛋白多肽類藥物，其藥用領(lǐng)域潛力很大。</p><p>　　目前國(guó)內(nèi)外利用SOD治療的病種有：氧中毒；惡性腫瘤；輻射損傷防護(hù)；抗炎作用等。雖然SOD是毒副作用很小的生物大分子，但作為抗原，多次注射體內(nèi)仍可誘發(fā)免疫

28、反應(yīng)和過敏反應(yīng)，而且其來(lái)源十分有限，故將SOD用作藥物的最理想的方法是進(jìn)行SOD的基因克隆和表達(dá)。近年來(lái)，美、日、英、等國(guó)已相繼開發(fā)了SOD基因工程產(chǎn)品，并進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)，日本三井東亞化學(xué)公司最早生產(chǎn)重組人Mn-SOD并將其用于治療心肌梗塞后缺血再灌注的心肌保護(hù)劑。</p><p>　　由于人的皮膚直接與氧氣接觸，會(huì)造成皮膚的老化和損傷。SOD在保護(hù)皮膚、防止氧化等方面的效果比較突出，為此也開發(fā)了一些富含SOD的

29、保健品，通過食用來(lái)抵抗衰老。</p><p>　　此外，國(guó)內(nèi)不少化妝品中都添加了SOD,如國(guó)內(nèi)的大寶SOD、康妮SOD、SOD康舒達(dá)霜等產(chǎn)品，對(duì)保養(yǎng)皮膚、防止衰老、阻止老年斑的生產(chǎn)有一定的效果[8]。</p><p>　　1.5 SOD分離提純的幾種主要方法</p><p>　　不管以何種途徑得到的SOD，其分離純化方法主要有沉淀法、熱變性法、色譜分離法、凝膠過濾

30、和離子層析柱法以及超濾法。其中沉淀法和熱變性法具有成本低、工藝簡(jiǎn)便、等特點(diǎn)，比較適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)SOD。但是也有他們不足的地方，例如沉淀法要用到丙酮這種有機(jī)物，無(wú)疑增加了對(duì)環(huán)境的污染和操作人員身體上的傷害。熱變性法則只能得到SOD的粗酶液，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。如果對(duì)產(chǎn)品的要求不高尚可以用此方法，如果要求得到高純度的SOD則此方法顯然不能滿足生產(chǎn)需要。相比較傳統(tǒng)的沉淀法、熱變性法，用色譜分離法、凝膠過濾和離子層析柱法以及超濾

31、法得到的SOD則純度更高，但是由于其成本較高，工藝過程復(fù)雜，提純周期較長(zhǎng)，因此比較適合實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模生產(chǎn)。</p><p>　　1.6 本實(shí)驗(yàn)所采用的SOD提純方法概述</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)利用重組SOD的熱穩(wěn)定性，用熱變性法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)，探索出一條比較簡(jiǎn)便易行的SOD分離提純方法。即先用超聲波法將大腸桿菌菌液破碎，再用熱變性法去除雜蛋白，得到SOD粗酶液，最后經(jīng)過

32、PEG20000濃縮和SepHadex G-100分子篩柱層析法去除小分子蛋白得到高純度的SOD酶液，同時(shí)對(duì)豬血中的SOD采用兩次丙酮沉淀法和熱處理工藝提純。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白濃度，用鄰苯三酚法測(cè)其活性，最后得出所提取的SOD的比活,并且測(cè)其熱穩(wěn)定性[9]。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p>　　2.1 材料與試劑</

33、p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　本課題組前期已經(jīng)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET -SOD并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）獲得重組菌。</p><p>　　1000ml豬血購(gòu)自菜市場(chǎng)。</p><p><b>　　2.1.2 試劑</b></p><p&g

34、t;　　Buffer A（為20mmol/L This-Hcl溶液）、PEG20000（Sigma公司）、SepHadex G-100(發(fā)瑪西亞）、鄰苯三酚溶液（4.5mmol/L）、考馬斯亮藍(lán)溶液（含0.01%(W/V)考馬斯亮藍(lán)G―250，4.7%(W/V)乙醇）、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（自配，1mg/mL的牛血清蛋白）、檸檬酸三鈉，氯化鈉，95%乙醇，氯仿，丙酮，KH2 PO4，K2HPO4，其余的為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?lt;/p>

35、<p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)儀器</b></p><p>　　本次實(shí)驗(yàn)用到的主要儀器有：紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用 TU1810）、恒溫水浴鍋（上海一恒 CU420）、自動(dòng)部分收集器（BIORAD Biologic LD）、磁力攪拌器（XK78-1 姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）、梯度混合器（BIORAD Biologic LD）、冷凍高速離心機(jī)（湘儀 21K）、電子天

36、平（賽多麗斯BS223S）、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（大連捷邁）、pH計(jì)（賽多麗斯 PB-10）、超聲破碎儀（無(wú)錫上佳 GA92-II D）、各種規(guī)格的移液槍（BIOHIT）、組織剪切機(jī)（上海標(biāo)本模型廠 DS-I）、冷凍層析柜（北京博醫(yī)康 YC-I）</p><p><b>　　2.3 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.3.1 微生物細(xì)胞中提取SOD</p>

37、<p>　　2.3.1 粗酶液的制備</p><p>　　將發(fā)酵液離心后收集菌體，稱取10g菌體，按1：20的比例溶解在200mL的Buffer A中，用組織剪切機(jī)間歇?jiǎng)驖{30min左右，得到大腸桿菌菌懸液，取50mL菌懸液，冰浴中用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)破碎細(xì)胞，超聲功率設(shè)定為200W，每次工作3S，停3S，持續(xù)30min。超聲液在4℃下7000rpm離心30min，獲得的上清液即為粗酶液[11]。&l

38、t;/p><p>　　2.3.1.2 粗酶液的熱變性處理</p><p>　　將SOD粗酶液置于90℃的恒溫水浴鍋加熱1h，4℃下7000rpm離心30min，棄沉淀，取上清共45mL。</p><p>　　2.3.1.3 PEG-20000濃縮SOD</p><p>　　在透析袋中加入上一個(gè)步驟得到的45mL上清，將透析袋平放在瓷盤上，瓷盤

39、中撒入PEG-20000，透析6h，收集得到的蛋白濃縮液，得濃縮的蛋白液10mL。</p><p>　　2.3.1.4 SepHadex G-100分子篩純化SOD[18]</p><p>　　2.3.1.4.1 SepHadex G-100凝膠的預(yù)處理</p><p>　　(1) 100mL燒杯，稱取5g sepHadex G-100，加入50mL去離子水

40、，浸泡溶脹24h。</p><p>　　(2) 傾去sepHadex G-100溶脹后凝膠上層的水，加入凝膠等體積的1.0 mol/L NaOH液處理，用攪棒輕輕攪動(dòng)，并浸泡1h處理后傾去。用去離子水洗滌。洗滌過程中，用傾去法除去細(xì)顆粒。其方法是用攪棒將凝膠攪勻（注意不要過分用力攪拌，以防止顆粒破碎），放置數(shù)分鐘，將未沉淀的細(xì)顆粒隨上層水倒掉。浮選5次，直至上層沒有細(xì)顆粒為止，再浸泡水洗至pH中性。</p

41、><p>　　(3) 將SepHadex G-100凝膠水溶液盛放于抽濾瓶中，用洗耳球塞住杯口，減壓抽氣30min，除去凝膠溶液內(nèi)的氣泡，將脫氣后的凝膠溶液輕輕倒入燒杯中，其中盛有1/2去離子水。</p><p>　　2.3.1.4.2 裝柱</p><p>　　（1）層析柱(50cm)用水清洗干凈，柱的上、下端聯(lián)接塑料管接上小乳膠管，裝上螺旋夾。將層析柱垂直裝好。校

42、直過程用下端綁有鑰匙的繩子掛于鐵架的不同位置，從多角度校正使柱垂直。打開柱上端口，從柱底下出口管朝柱內(nèi)注入水，使柱底全部充滿水而不留氣泡，關(guān)閉柱出口。最終柱內(nèi)留存有2 cm的水。從出口處接上一根直徑2 mm細(xì)塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。</p><p>　?。?）攪動(dòng)凝膠溶液（切勿攪動(dòng)太快，以免空氣再逸入），使形成均一的薄膠漿，并立即沿玻棒倒入層析管內(nèi)，讓加入的凝膠在柱內(nèi)自然沉降，待柱底面上積起約1-2

43、cm的凝膠床后，打開柱出口水流。隨著柱內(nèi)水的流出，上面不斷加入凝膠液，使形成的凝膠床面上有凝膠連續(xù)下降（如果凝膠床面上不再有凝膠顆粒下降，應(yīng)該用攪棒均勻地將凝膠床攪起數(shù)厘米高，然后再加凝膠，不然就會(huì)形成界面，影響層析效果）。</p><p>　?。?）凝膠沉積到柱內(nèi)凝膠是否均勻，有否“紋路”或氣泡。若層析柱不均一，必須重新裝柱。</p><p>　　2.3.1.4.3 平衡</p&

44、gt;<p>　　柱裝好后，使層析床穩(wěn)定15min，然后連接洗脫瓶出口和層析柱頂端，用5倍體積地緩沖液平衡層析柱。平衡過程中控制上柱緩沖液地進(jìn)柱操作壓保持恒定。保持流速每滴/8s。直至流出液的pH與上柱緩沖液完全相同。</p><p>　　2.3.1.4.4 樣品洗脫</p><p><b>　?。?）上樣前準(zhǔn)備</b></p><p

45、>　　i) 上樣前打開層析柱上端，先檢查凝膠床界面是否平整，如果傾斜不平整，可用玻棒將凝膠床界面輕輕攪起后，再使凝膠自然沉降，形成平整狀態(tài)的凝膠床界面。用毛細(xì)吸管小心吸去大部分清液，然后讓液面自然下降，直至幾乎露出凝膠床界面。</p><p>　　ii) 樣品放入高速離心機(jī)，12000r/min、離心5 min，取上清。</p><p>　　iii) 上樣前吸取50µL樣品

46、于EP管中，以備走電泳。</p><p><b>　?。?）樣品上樣</b></p><p>　　i) 將樣品由玻棒引流沿管壁加入到凝膠床面上，注意不要將床面凝膠沖起。同時(shí)打開層析柱下面流出液開關(guān)（控制流速1滴/20s），保持層析柱下面流出滴速與上樣的滴速一致，控制凝膠床界面不能脫水，并控制樣品區(qū)帶盡量狹窄。 </p><p>　　ii) 當(dāng)2

47、mL樣品全部加入后，用 1-2 mL的0.5mol/L pH8.0 Tris-HCl洗脫液同上樣時(shí)一樣地保持層析柱下面流出滴速與上樣的滴速一致以控制凝膠床界面不能脫水，小心清洗凝膠床界面表面，使黏附著的樣品全部洗入凝膠床。</p><p>　　iii) 然后開始控制上樣的滴速大于層析柱下面流出滴速，使幾乎與凝膠床界面相平的洗脫液液面慢慢提高至凝膠床界面高出2cm左右，封閉層析柱上端。 </p>&l

48、t;p>　　iv) 保持層析柱上柱洗脫液入口處與層析柱下面流出處有一定勢(shì)壓?？刂粕现彌_液的進(jìn)柱操作壓保持恒定。</p><p><b>　?。?）洗脫</b></p><p>　　用0.1 mol/L pH8.0 Tris-HCl 緩沖液洗脫，用部分收集器收集，5min/管（約2-3mL/管），收集約1-60管。用A280測(cè)其吸光度，將酶活部分的收集液合并。&

49、lt;/p><p>　　2.3.1.5 SOD活性的測(cè)定：鄰苯三酚法[14] [15]</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚法測(cè)定SOD酶液的活度，其原理為：在堿性條件下，鄰苯三酚會(huì)發(fā)生自氧化反應(yīng)，可以根據(jù)SOD抑制鄰苯三酚自氧化能力來(lái)測(cè)定SOD的活力</p><p>　　規(guī)定1mLpH8.0，30℃的反應(yīng)體系內(nèi)能抑制鄰苯三酚自氧化50%所需的酶量稱為一個(gè)酶活單位。

50、樣品液中每mg 蛋白的總SOD 活力單位數(shù)稱為樣品液的SOD 比活力(U?mg - 1) 。</p><p>　　配置4.5mmol/mL的鄰苯三酚溶液和pH8.3的20mmol/mL的PBS緩沖液，按照表2-1的試劑用量，將緩沖液加入試管再加入SOD樣液，并在25 ℃保溫25 min，然后加入同樣預(yù)熱的鄰苯三酚，用梯度混合器迅速混勻，吸取750uL加入到1cm的比色杯中，在325nm處每隔30s測(cè)定一次吸光度，

51、選擇時(shí)間范圍，控制對(duì)照管每分鐘吸光度的變化速率在0.070左右（即△A325=0.070），記錄樣品溶液每分鐘吸光度變化值△A1 。</p><p><b>　　酶活力的計(jì)算公式：</b></p><p>　　SOD活力（U/mL）=</p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　

52、U/mL ——SOD酶活力單位；</p><p>　　△A325 ——鄰苯三酚自氧化速率，即0.070；</p><p>　　△A1 —— 樣液或SOD酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率；</p><p>　　V—— 所加酶液或樣液體積，單位為mL；</p><p>　　D——酶液或樣液的稀釋倍數(shù)；</p><p>　　3—

53、—反應(yīng)液總體積，單位為mL.</p><p>　　表2-1 SOD活力測(cè)定加樣表</p><p>　　2.3.1.6 SOD酶液濃度的測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)法[12] [13]</p><p>　　考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量的測(cè)定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍(lán)G－250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過

54、范德華力結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beer’s law）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。</p><p>　　2.3.1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</p><p>　　分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.

55、5、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于10 mL具塞試管中，各管加水至1mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5mL,混勻，放置10 min,，于595nm處測(cè)定其吸光度。</p><p>　　2.3.1.6.2 樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定</p><p>　　取供試品溶液各1 mL, 同時(shí)做三個(gè)重復(fù), 以空白試劑為參比, 按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定法, 分別測(cè)定其吸光度值, 計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含

56、量。</p><p>　　2.3.1.7 聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）</p><p>　　2.3.1.7.1 電泳凝膠的制備</p><p>　?。?）清洗干凈兩塊玻璃板，晾干后按要求裝配好垂直電泳板，裝版時(shí)因?qū)蓧K板加緊以防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出。</p><p>　　（2）將裝好的玻璃電泳板傾斜成45°。把玻璃

57、板在灌膠支架上固定好。</p><p>　?。?）分離膠：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例，先將貯備液1，3和水放在一小燒杯中，過硫酸銨貯備液放在另一小燒杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽氣15min，取出將過硫酸銨溶液并入，用玻棒輕輕攪動(dòng)使之混合，立即注于干潔的玻璃板中。玻璃板垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要進(jìn)入氣泡。膠液注到離玻璃板口2cm處，立即在其表面覆蓋少量蒸餾水，靜置1h，當(dāng)

58、見到水層下面有一清晰的界面時(shí)，則表明膠已聚合凝固，用吸水紙小心吸去上面水層。 </p><p>　　（5） 濃縮膠：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例，同上法制備濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40min。</p><p>　　2.3.1.7.2 樣品預(yù)處理</p><p>　　將蛋白質(zhì)樣品與5×樣品緩沖液（20uL＋

59、5uL）在一個(gè)Eppendorf管中混合。放入100℃加熱20min，離心，取上清點(diǎn)樣。</p><p>　　2.3.1.7.3 加樣</p><p>　　用微量注射器吸取經(jīng)處理過的Maker和樣液15μL，作為每次的加樣量。加樣時(shí)，將微量注射器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動(dòng)微量注射器，注意針頭勿碰破凹形槽膠面。</p><p>　　2.

60、3.1.7.4 電泳</p><p>　　電壓220V，溴酚藍(lán)剛跑出分離膠時(shí)，停止電泳，需45 min。</p><p>　　2.3.1.7.5 凝膠板的剝離、染色及脫色</p><p>　　卸下膠板，剝離膠放入染色液中，室溫染色1.5h，加入脫色液，置于80 rpm脫色搖床上，每20 min更換一次脫色液（10 mL 冰乙酸；45 mL乙醇；45 mL蒸餾水）

61、至完全脫凈。; V* K% q0</p><p>　　2.3.1.8 微生物SOD分離純化的工藝流程圖[16]</p><p>　　2.3.1.9 SOD最適溫度和熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)</p><p>　　將最后分離純化得到的酶液分2組分別取500uL在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，一組直接測(cè)其酶活另一組放置恒溫水浴中加熱2h，測(cè)其酶活

62、，每個(gè)溫度梯度重復(fù)3次，求平均值，確定SOD酶活與溫度的關(guān)系。</p><p>　　2.3.2 豬血中提取SOD</p><p>　　2.3.2.1 分離紅血球: </p><p>　　取新鮮豬血1000mL, 加入0.8%（體積比）的檸檬酸三鈉，攪拌均勻。用紗布濾除雜質(zhì)，濾液在0～4℃條件下、以3000 r /min離心10min。棄去上清液, 收集下層紅血球,

63、 得到約400mL的紅血球。</p><p>　　2.3.2.2 洗滌紅血球</p><p>　　向血球中加入兩倍體積的0.9%的生理鹽水，進(jìn)行洗滌。并在條件1下離心。重復(fù)洗滌至上清液呈透明狀（大約洗滌2～3次）,收集紅血球。</p><p>　　2.3.2.3 溶解破碎血細(xì)胞</p><p>　　將洗滌后的紅血球置于燒杯中，加入等體積的蒸餾

64、水，于0～4℃條件下攪拌溶血30min，并在0～4℃的冰箱中靜置過夜，使之溶血充分。</p><p>　　2.3.2.4 萃取</p><p>　　向溶血液中分別緩緩加入預(yù)冷 -4℃的0.5 倍體積95%乙醇和0.5 倍體積丙酮,攪拌15min,在0～4℃下靜置50min、以離心速度為4000r/min離心20min。取上清液、過濾，得到SOD溶液。</p><p>

65、;　　2.3.2.5 第一次丙酮沉淀</p><p>　　向第4步所得的SOD溶液中加入預(yù)冷至 -4℃的丙酮直至不再出現(xiàn)沉淀，低溫下靜置20min, 4℃下、以3000 r/min離心5min。取沉淀，用50倍體積的pH值7.6的磷酸鉀緩沖液溶解，過濾除去不溶性蛋白。</p><p>　　2.3.2.6 熱處理</p><p>　　向第5步所得的溶液中加入5%體積0

66、.01mol/L 的CuCl2溶液,于60℃水浴中加熱15min，取出迅速冷卻，待冷卻至4℃以下時(shí)，于同樣溫度下3000 r/min離心8min,棄去沉淀。</p><p>　　2.3.2.7二次丙酮沉淀</p><p>　　向第6步所得的清液中加入預(yù)冷至-4℃的丙酮直至不再出現(xiàn)沉淀，低溫下靜置20min, 4℃條件下以3000 r/min離心5min，取沉淀、用50倍體積的蒸餾水溶解，過

67、濾除去不溶性蛋白。</p><p>　　2.3.2.8 豬血SOD分離純化的工藝流程圖[17]</p><p>　　豬血中SOD制備步驟</p><p>　　2.3.2.9 豬血中SOD活性的測(cè)定：鄰苯三酚法，同2.3.1.5。</p><p>　　2.3.2.10 豬血中SOD酶液濃度的測(cè)定：考馬斯亮藍(lán)法，同2.3.1.6。</p

68、><p>　　2.3.2.11 豬血中SOD熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：同2.3.1.9。</p><p>　　2.3.2.12 pH值對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)</p><p>　　取10支10mL試管，分別加入pH為3~12的緩沖液3mL，再加入等量酶液，在25℃水浴中保溫20min后測(cè)酶活，以雙蒸水中的酶活性為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算相對(duì)酶活性。3 結(jié)果與討論</p><p&

69、gt;　　3.1 基因工程菌SOD的各種性質(zhì)</p><p>　　3.1.1 PEG-20000濃縮SOD</p><p>　　經(jīng)PEG-20000濃縮得到SOD粗酶濃縮液10mL。</p><p>　　3.1.2 SepHadex G-100分子篩純化SOD</p><p>　　用pH8.0的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液

70、平衡，將PEG濃縮后的酶液取1mL上樣，紫外檢測(cè)收集并檢測(cè)活性，結(jié)果如圖3-1所示。</p><p>　　從以上的圖片中可以見，圖中，位于上方的為A280的吸光度曲線，位于下方的是酶液的蛋白活力曲線，通過比較可以知道A280吸光度曲線和蛋白活力的曲線在第40-55管酶液發(fā)生了重合，因此將第40管到55管中的酶液就是我們要收集的目的蛋白酶液，將其合并。</p><p>　　3.1.3 考馬

71、斯亮藍(lán)法測(cè)定SOD酶液蛋白濃度結(jié)果</p><p>　　3.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</p><p>　　用紫外分光光度計(jì), 以試劑空白參比, 在595 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定對(duì)照品溶液吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo), 蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3-2。</p><p>　　得其線性回歸方程式Y(jié)=0.00635X+0.15735, R2=0.99859, 相關(guān)系數(shù)

72、r=0.9993, 表明蛋白質(zhì)在1.67μg/mL--16.67 μg/mL 范圍內(nèi)很好地符合郎伯-比爾( Lamber-Beer) 定律。</p><p>　　3.1.3.2 樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果</p><p>　　將樣液①稀釋10000倍，②、③分別稀釋1000倍后，在595nm處測(cè)得其吸光值再帶入線性方程再乘以其稀釋倍數(shù)得出其蛋白濃度分別為見表3-1。</p>&

73、lt;p>　　表3-1 樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果</p><p>　　3.1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果</p><p>　　根據(jù)各個(gè)步驟留樣的樣品，做SDS-PAGE電泳，結(jié)果鑒定圖如圖3-3所示</p><p>　　1，SOD粗酶液； 2，經(jīng)熱變性離心后的SOD粗酶液；3，經(jīng)DEAE-SepHadexA-100分子篩純化后的SOD酶液。

74、</p><p>　　從圖3-3的電泳鑒定圖中可以看出，經(jīng)超聲破碎后的SOD粗酶液的電泳圖譜中有很多條蛋白質(zhì)帶,說明經(jīng)過超聲破碎后的SOD粗酶液中還有很多分子量不同的雜質(zhì)蛋白，在熱變性處理后的酶液中大分子雜蛋白明顯減少了很多,我們的目的蛋白的分子量是28000道爾頓,在電泳圖譜中最粗的那條蛋白帶就是目的蛋白的條帶。在經(jīng)過SepHadex G-100分子篩純化后，可見雜蛋白幾乎是沒有了，只有目的蛋白分子量處有一條較

75、細(xì)的蛋白帶，這是由于上樣量比較少的緣故。由此可見，在經(jīng)過SepHadex G-100分子篩純化后，得到了高純度的SOD。</p><p>　　3.1.5 基因工程菌SOD熱穩(wěn)定性試驗(yàn)</p><p>　　對(duì)經(jīng)過DEAE-SepHadexA-100分子篩純化后的SOD酶液按設(shè)定的試驗(yàn)步驟進(jìn)行最適溫度的確定實(shí)驗(yàn)，得出相對(duì)活性和溫度的關(guān)系表，繪制出SOD酶活和溫度的關(guān)系圖見表3-3。</

76、p><p>　　表3-3 SOD相對(duì)活性和溫度關(guān)系表</p><p>　　由上表可以看出在溫度小于90℃下基因工程菌SOD酶活仍能保持較高的活性。受溫度影響比較小?？傮w來(lái)說，基因工程菌SOD酶有非常高的熱穩(wěn)定性。</p><p>　　3.1.6 pH值對(duì)酶活性的影響試驗(yàn)</p><p>　　對(duì)經(jīng)過DEAE-SepHadexA-100分子篩純

77、化后的SOD酶液按設(shè)定的試驗(yàn)步驟進(jìn)行最適pH的確定實(shí)驗(yàn)，得出相對(duì)活性和pH的關(guān)系表見表3-4，并繪制出SOD酶活和pH的關(guān)系圖見圖3-4。</p><p>　　表3-4 酶活和pH的關(guān)系</p><p>　　圖3-4 SOD酶活和pH的關(guān)系圖</p><p>　　在pH6~8范圍內(nèi)，酶相對(duì)活性高且穩(wěn)定且最適pH為7，在 pH<6時(shí)，酶相對(duì)活性隨pH的增加而增加

78、。</p><p>　　3.2 豬血中SOD的各種性質(zhì)</p><p>　　3.2.1 樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果</p><p>　　將樣液④稀釋10000倍，⑤、⑥分別稀釋1000倍后，在595nm處測(cè)得其吸光值再帶入線性方程再乘以其稀釋倍數(shù)得出其蛋白濃度分別為見表3-5。</p><p>　　表3-5 樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果</p&

79、gt;<p>　　3.2.2 豬血SOD熱穩(wěn)定性試驗(yàn)</p><p>　　對(duì)采用兩次丙酮沉淀法和熱處理工藝提純豬血SOD并得出相對(duì)活性和溫度的關(guān)系表，繪制出豬血SOD酶活和溫度的關(guān)系圖見表3-6。</p><p>　　表3-6 豬血SOD相對(duì)活性和溫度關(guān)系表</p><p>　　由上表發(fā)現(xiàn)在溫度小于60℃下，豬血SOD酶活保持著良好的活性，溫度繼續(xù)上升

80、則酶活急速下降?？傮w來(lái)說，豬血SOD酶還是有較高的熱穩(wěn)定性。</p><p>　　pH值對(duì)酶活性的影響試驗(yàn)</p><p>　　對(duì)采用兩次丙酮沉淀法和熱處理工藝提純豬血SOD并得出相對(duì)活性和pH的關(guān)系表，繪制出豬血SOD酶活和pH的關(guān)系圖見表3-7，并作出曲線圖3-5。</p><p>　　表3-7 豬血SOD相對(duì)酶活和pH關(guān)系表</p><p

81、>　　圖3-5 豬血SOD相對(duì)酶活和pH關(guān)系</p><p>　　在pH6~9范圍內(nèi)，酶相對(duì)活性高且穩(wěn)定，在 pH<6時(shí)，酶相對(duì)活性隨pH的增加而增加，當(dāng)pH>9時(shí)，酶相對(duì)活性隨pH增加而減少，酶分子的構(gòu)像發(fā)生不可逆的轉(zhuǎn)變，并喪失活性。</p><p>　　基因工程菌SOD及豬血SOD性質(zhì)比較</p><p>　　3.3.1 在酶活方面用鄰苯三酚法

82、測(cè)定留樣的酶活</p><p>　　用鄰苯三酚法測(cè)定結(jié)果如表3-8所示。</p><p>　　1，微生物中SOD粗酶液； 2，經(jīng)熱變性離心后的微生物SOD粗酶液；3，經(jīng)DEAE-SepHadexA-100分子篩純化后的SOD酶液。4，豬血中SOD粗酶液； 5，經(jīng)熱變性離心后的豬血SOD粗酶液；6，兩次丙酮沉淀后的SOD成品</p><p>　　從酶活的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，

83、我們留樣的六管酶液中的SOD的活力值還是比較高的，除了④、⑤號(hào)管，均達(dá)到了3000個(gè)活力單位以上每毫升，可見我們采用的破菌方法——超聲波破菌法和溶解破碎血細(xì)胞的破碎成果還是比較理想的。④、⑤號(hào)管酶活較低應(yīng)該是由于酶液初提，雜質(zhì)蛋白較多，導(dǎo)致酶活過低。</p><p>　　3.3.2 在最適溫度方面</p><p>　　對(duì)經(jīng)過DEAE-SepHadexA-100分子篩純化后的SOD酶液和采用

84、兩次丙酮沉淀法和熱處理工藝提純豬血SOD按設(shè)定的試驗(yàn)步驟進(jìn)行最適溫度的確定實(shí)驗(yàn)并得出相對(duì)活性和溫度的關(guān)系如圖3-6。</p><p>　　圖3-6 SOD活性和溫度的關(guān)系表</p><p>　　由上圖可知，豬血SOD最適溫度在40℃，基因工程菌SOD的最適溫度在90℃，二者的差別還是非常大的。</p><p>　　3.3.3 在熱穩(wěn)定性方面</p>&

85、lt;p>　　對(duì)經(jīng)過DEAE-SepHadexA-100分子篩純化后的SOD酶液和采用兩次丙酮沉淀法和熱處理工藝提純豬血SOD按設(shè)定的試驗(yàn)步驟進(jìn)行相對(duì)酶活和溫度的關(guān)系并得出相對(duì)活性和溫度的關(guān)系表，繪制出基因工程菌SOD酶活和溫度的關(guān)系圖見表3-3。以及豬血SOD酶活和溫度的關(guān)系圖見表3-6。比較得到圖3-7。</p><p>　　從圖3-5可見，總體來(lái)說SOD酶的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，在較長(zhǎng)的區(qū)間內(nèi)都能保持非常高的

86、穩(wěn)定性。其中在60℃的溫度下仍能保持較高的相對(duì)活性，可以用熱變性法對(duì)其進(jìn)行分離純化。其中基因工程菌中SOD在溫度小于90℃時(shí)酶活性保持良好，而豬血中SOD在溫度小于70℃時(shí)酶活性保持良好，溫度大于70℃酶失活明顯，其熱穩(wěn)定性下降。在溫度大于60℃以后，隨著溫度的上升豬血SOD熱穩(wěn)定性比基因工程菌的高了10-30℃。顯示出基因工程菌SOD酶的熱穩(wěn)定性是相當(dāng)高的。</p><p>　　3.3.4 在最適pH方面<

87、;/p><p>　　對(duì)經(jīng)過DEAE-SepHadexA-100分子篩純化后的SOD酶液和對(duì)采用兩次丙酮沉淀法和熱處理工藝提純豬血SOD進(jìn)行對(duì)比得到相對(duì)活性與pH的關(guān)系圖3-8。</p><p>　　圖3-8 對(duì)活性與pH的關(guān)系圖</p><p>　　上面的為豬血SOD下面的為基因工程菌SOD的線性關(guān)系</p><p>　　在pH6~9范圍內(nèi)，酶相

88、對(duì)活性高且穩(wěn)定，在 pH<6時(shí)，酶相對(duì)活性隨pH的增加而增加，當(dāng)pH>9時(shí)，酶相對(duì)活性隨pH增加而減少，酶分子的構(gòu)像發(fā)生不可逆的轉(zhuǎn)變，并喪失活性。</p><p><b>　　3.4 討論</b></p><p>　　從SOD活性與溫度的關(guān)系圖上可以看出，該酶在60℃左右還保持著良好的活性，說明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。在分離提純的時(shí)候就可以用熱變性法來(lái)代

89、替?zhèn)鹘y(tǒng)的硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白的方法，減少了化學(xué)藥品的使用，降低成本，操作簡(jiǎn)單，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。</p><p>　　從SOD活性與pH的關(guān)系圖上可以看出，該酶在pH為6-8時(shí)保持著良好的活性，在pH為7時(shí)有最高酶活。為以后工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。</p><p>　　本次實(shí)驗(yàn)采用熱變性法和G-100凝膠過濾層析相結(jié)合的方法，取長(zhǎng)補(bǔ)短，實(shí)現(xiàn)了SOD的純化過程，比活由粗酶液的2482U/mg提高

90、到了最終產(chǎn)品的8145U/mg，純化倍數(shù)為3.3倍，蛋白回收率為80.5%，為今后的大規(guī)模生產(chǎn)SOD提供了一定的依據(jù)。</p><p>　　基因工程菌中提取的SOD有這樣的性質(zhì)是由于嗜熱菌的代謝過程和特殊的生物學(xué)功能，其中嗜熱菌[10]，又稱高溫細(xì)菌、嗜熱微生物。它是一類生活在高溫環(huán)境中的微生物，如火山口及其周圍區(qū)域、溫泉、工廠高溫廢水排放區(qū)等。在這樣的環(huán)境下生存，可想而知通過基因工程技術(shù)將其中的可用基因片段導(dǎo)入

91、到E.coil中，使其表達(dá)，所得到的酶在最適溫度及熱穩(wěn)定性較一般的酶高。同時(shí)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。豬血的SOD最適溫度只有40℃同時(shí)酶活在60℃以上就開始顯著下降了，而基因工程菌的SOD最適溫度在90℃同時(shí)酶活則在90℃下還是保持在80%以上，只是略微下降了一點(diǎn)。這是由在極端條件下的酶和蛋白質(zhì)的功能所決定的。從這些嗜熱極端微生物中分離出來(lái)的酶具有極高的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和耐受物理、化學(xué)變性劑的優(yōu)良特性，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

92、</p><p>　　總而言之，這種菌體的高穩(wěn)定性使得酶也具有高穩(wěn)定性，一定程度上降低了工藝要求，將基因片段導(dǎo)入了E.coil使其表達(dá)，而培養(yǎng)E.coil的條件相對(duì)其中嗜熱菌要簡(jiǎn)單的多，就是說可以通過培養(yǎng)E.coil來(lái)生產(chǎn)這種酶，而不用去培養(yǎng)難培養(yǎng)的嗜熱菌來(lái)生產(chǎn)，也提高了生產(chǎn)效率。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>

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