不同來源人參皂甙免疫佐劑作用的研究.pdf

1、本論文研究了人參根皂甙、紅參皂甙、人參莖葉皂甙、人參皂甙單體Re和人參皂甙納米顆粒的免疫佐劑作用,為進(jìn)一步研究開發(fā)人參皂甙提供參考。1.人參根皂甙免疫佐劑作用研究
　　 目的：觀察人參根皂甙經(jīng)胃腸道途徑給藥對皮下注射的口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型和流感病毒H3N2型滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)一:將小鼠分別灌服250μl含0.5、5或50μgGS-N溶液,對照組灌服250μl蒸餾水,1天后皮下注射100μl FMDV

2、抗原,同樣方法免疫2次,間隔3周；實(shí)驗(yàn)二:將小鼠連續(xù)3天,每天灌服250μl含50、100或200μg GS-N溶液,對照組灌服蒸餾水,然后皮下注射含10 ng HA的流感病毒疫苗,同樣方法免疫2次,間隔3周。實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二小鼠均在二免后2周采血測抗體水平,實(shí)驗(yàn)二中小鼠取小腸空腸中段進(jìn)行免疫組化觀察IgA+漿細(xì)胞數(shù)量變化。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一小鼠灌胃1次50μg GS-N能提高血清抗FMDV抗體IgG水平,但和對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)

3、差異。實(shí)驗(yàn)二中每天灌服一次100μg GS-N,連續(xù)3天的小鼠血清中抗流感HA特異性抗體IgG效價(jià),IgG1、IgG2b和IgG3水平均顯著提高,且腸道IgA+漿細(xì)胞明顯增多,說明黏膜免疫功能得到增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：1次口服GS-N雖然提高了小鼠對皮下注射FMD抗原的免疫反應(yīng),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；連續(xù)3天口服GS-N可以顯著提高小鼠對流感疫苗的免疫反應(yīng),以及增加腸道IgA+漿細(xì)胞數(shù)量。2.紅參皂甙(GS-R)免疫佐劑作用研究

4、　　 目的：觀察疫苗中添加紅參皂甙或口服GS-R對疫苗接種有無免疫增強(qiáng)作用。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)一:將20只ICR小鼠隨機(jī)分成4組,每組5只。以O(shè)VA為模式抗原,分別設(shè)含人參皂甙10、50或250μg GS-R組,對照組僅免疫10μg OVA。免疫2次,間隔3周。二次免疫后2周采血,檢測血清抗OVA抗體IgG水平。實(shí)驗(yàn)二:實(shí)驗(yàn)組小鼠分別在實(shí)驗(yàn)第1天和第21天灌胃250μl含0.5、5或50μg GS-R的蒸餾水溶液,對照組小鼠同

5、時(shí)灌服250μl蒸餾水。在第2天和第22天,每組小鼠均皮下注射100μl FMDV抗原。即實(shí)驗(yàn)組小鼠在每次免疫前灌胃一次GS-R,小鼠免疫2次,間隔3周。二免后2周,小鼠采血分離血清,檢測血清抗FMDV抗體IgG水平。
　　 結(jié)果與結(jié)論：實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二結(jié)果表明,紅參皂甙和抗原混合以及在動(dòng)物對注射OVA或FMDV抗原前口服均不能增強(qiáng)相應(yīng)的的免疫應(yīng)答,因而紅參皂甙不具有免疫佐劑作用。3.人參莖葉皂甙(GSLS)免疫佐劑作用研究

6、>　　 目的：口服人參莖葉皂甙(GSLS)對皮下注射FMDV抗原或者流感疫苗的免疫增強(qiáng)作用。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)一:實(shí)驗(yàn)組小鼠在免疫前一天灌服0.5、5或50μg GSLS,對照組灌服250μl蒸餾水。小鼠皮下注射100μl FMDV抗原,同樣方法免疫2次,間隔3周。二免后2周采血分離血清,檢測血清抗:FMDV抗體IgG水平；實(shí)驗(yàn)二:實(shí)驗(yàn)組小鼠在免疫前連續(xù)三天灌服50、100或200μg GSLS,對照組同時(shí)灌服蒸餾水,完成3天

7、灌胃后,小鼠皮下注射含10 ng HA抗原的流感疫苗,同樣方法免疫2次,間隔3周。在二免后2周采血測血清抗HA特異性抗體IgG滴度及其亞類水平,并取小鼠小腸空腸中段制作組織石蠟切片,免疫組化比較口服GSLS組和對照組IgA+漿細(xì)胞數(shù)量。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一:小鼠2次免疫前均灌胃一次0.5或50μgGSLS能提高血清抗FMDV抗體IgG水平,但和對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)二:連續(xù)口服3天,每天灌服50μg GSLS使小鼠抗流感H

8、A特異性抗體IgG效價(jià),IgG1和IgG2b水平均顯著提高(P＜0.05),小鼠空腸中段組織中IgA+漿細(xì)胞明顯增多,提示黏膜免疫功能得到增強(qiáng)。總體上,通過抗體及其亞類和腸道IgA+漿細(xì)胞變化可知,口服低劑量人參莖葉皂甙提高了機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的同時(shí),還增強(qiáng)胃腸道局部黏膜免疫水平,即口服GSLS對皮下注射FMD抗原和流感H3N2病毒抗原均顯示一定的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)論：小鼠灌胃1次GSLS能提高機(jī)體對皮下注射FMDV抗

9、原的體液免疫水平,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；連續(xù)3天口服GSLS可提高小鼠對流感疫苗的抗體免疫反應(yīng),并增加腸道IgA+漿細(xì)胞數(shù)量。4.人參皂甙單體Re免疫佐劑作用研究
　　 目的：觀察人參皂甙Re對流感病毒疫苗的免疫佐劑作用。
　　 方法：40只ICR小鼠隨機(jī)分成5組,每組8只。組1:10 ng HA(注射含10 ng HA抗原的流感疫苗,下同)；組2:100μg HA組；組3:10 ng HA+25μgRe組；組4:10 ng

10、HA+50μg Re；組5:10 ng HA+100μg Re組。小鼠腹部皮下注射200μl含上述組分的疫苗,免疫2次,間隔3周。二免后2周摘眼球采血分離血清,間接ELISA法檢測血清抗血凝素HA抗體效價(jià)及抗體亞類IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3水平,并測血凝抑制效價(jià)HI；無菌分離脾淋巴細(xì)胞后,采用MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖和ELISA法檢測Con A刺激培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平。
　　 結(jié)果：在含10 ng HA的流感疫

11、苗中添加50μg Re能顯著提高ICR小鼠血清中抗HA特異性IgG效價(jià),IgG1、IgG2a和IgG2b水平,以及HI效價(jià)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力(P＜0.05),顯著刺激淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-5(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：流感疫苗中添加人參皂甙Re能顯著提高受免小鼠特異性抗體IgG和抗體亞類水平,增強(qiáng)血清HI效價(jià),顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和分泌細(xì)胞因子水平,表明Re對流感疫苗免疫具有佐劑作用。5.人參皂甙的納米

12、顆粒(Ginsomes)制備及其佐劑作用研究
　　 目的：研究人參皂甙納米顆粒(Ginsomes)的制備方法、顆粒物理形態(tài)及其對模式抗原OVA的免疫佐劑作用。
　　 方法：分別選取三種人參皂甙:人參根皂甙、人參莖葉皂甙和紅參皂甙,與膽固醇、卵磷脂(膽固醇和卵磷脂預(yù)先溶于Mega-10)形成不同配比方案,將混合溶液置于不同溫度(10、20、30、40和50℃)孵育2 h,此后對PBS透析48 h以移除去污劑Mega-10,

13、此時(shí),皂甙、膽固醇和卵磷脂形成的納米顆粒產(chǎn)物采用2％磷鎢酸溶液負(fù)染后進(jìn)行透射電鏡鑒定。電鏡確認(rèn)納米顆粒形成后,設(shè)計(jì)ICR小鼠試驗(yàn)檢驗(yàn)納米顆粒的免疫佐劑作用。在實(shí)驗(yàn)一中選取不同人參皂甙濃度的紅參皂甙和Ginsomes(含人參皂甙分別為10、50或250μg)與無內(nèi)毒素污染的卵清白蛋白(OVA)混合后免疫小鼠,間隔3周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫,二免后2周取血清進(jìn)行抗OVA特異性抗體水平測定；實(shí)驗(yàn)二:將32只ICR小鼠隨機(jī)分成4組,每組8只。以O(shè)VA

14、(每只免疫劑量為10μg)為模式抗原,分別設(shè)含人參皂甙50μg的Ginsomes組,含人參皂甙50μg的人參皂甙GS組和50μg Quil A組,對照組僅免疫OVA?？乖妥魟┗旌暇鶆蚝?腹部皮下注射疫苗,在第1天和第21天分別進(jìn)行2次免疫。第14天從小鼠眼靜脈竇采血,第35天摘眼球采血并分離脾臟淋巴細(xì)胞。間接ELISA法檢測血清抗OVA抗體效價(jià)及抗體亞類IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3水平；取脾淋巴細(xì)胞,采用MTT法檢測淋巴

15、細(xì)胞增殖和ELISA法檢測OVA刺激培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平。
　　 結(jié)果：透射電子顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn),三種不同來源人參皂甙中只有紅參皂甙能制備形成Ginsomes；形成納米顆粒的最佳條件為紅參皂甙:膽固醇:卵磷脂以質(zhì)量比20:1:1混合,納米顆粒平均粒徑為:87..8±9.4 nm。小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)一中各個(gè)濃度顆粒均誘導(dǎo)出顯著高于人參總皂甙免疫小鼠血清抗體水平的特異性IgG(P＜0.05),實(shí)驗(yàn)二中含50μg人參皂甙的納

16、米顆粒能顯著提高ICR小鼠血清中抗OVA特異性IgG效價(jià),IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體水平,以及受特異性抗原OVA刺激的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和細(xì)胞因子IFN-γ和IL-5的分泌(P＜0.05),說明人參皂甙納米顆粒作為免疫佐劑能同時(shí)上調(diào)Th1和Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　 結(jié)論：紅參皂甙制備的納米顆粒Ginsomes粒徑約為90 nm,OVA與納米顆?；旌厦庖呖娠@著提高血清抗體IgG及其亞類水平,并顯著增強(qiáng)小鼠脾淋

17、巴細(xì)胞受OVA刺激的增殖能力和分泌IFN-γ和IL-5水平。
　　 綜上所述,(1)小鼠皮下注射FMD抗原前灌胃1次GS-N提高了體液免疫水平,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；注射流感疫苗前連續(xù)3天口服GS-N可顯著提高小鼠抗流感抗原的免疫反應(yīng),并增加腸道IgA+漿細(xì)胞數(shù)量。(2)OVA抗原和GS-R混合或皮下注射口蹄疫疫苗前灌服1次GS-R均未顯著增強(qiáng)機(jī)體對抗原特異性免疫反應(yīng),因而紅參皂甙不具有免疫佐劑作用。(3)小鼠口服1次GSLS能提高機(jī)

18、體對皮下注射FMD抗原的體液免疫水平,但無顯著性差異；連續(xù)3天口服GSLS可提高小鼠對流感疫苗的體液反應(yīng)水平,增加腸道IgA+漿細(xì)胞數(shù)量。(4)流感疫苗中添加人參皂甙Re顯著促進(jìn)小鼠抗體IgG和抗體亞類水平,提高血清HI效價(jià),并顯著增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力和促進(jìn)IFN-γ和IL-5的分泌,表明Re對流感疫苗免疫具有佐劑作用。(5)紅參皂甙與膽固醇、卵磷脂在質(zhì)量比20:1:1配比條件下可制備Ginsomes,在OVA溶液中添加納米顆?？娠@著