產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌免疫佐劑作用的初步研究.pdf

1、研究目的:
　　 體外研究產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌(Corynebacteriumpyruviciproducens,C.pyruviciproducens)對(duì)抗原提呈細(xì)胞免疫功能的影響:進(jìn)而以BALB/c小鼠為對(duì)象,探討產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌的免疫佐劑作用,為C.pyruviciproducens作為新的細(xì)菌性免疫佐劑積累試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 研究方法:
　　 (1)以痤瘡丙酸桿菌(已經(jīng)被廣泛認(rèn)可的細(xì)菌佐劑)為參照,產(chǎn)丙酮酸棒狀

2、桿菌刺激樹突狀細(xì)胞(Dendriticcell,DC)和巨噬細(xì)胞(Macrophage,Mφ)后,熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平的變化,ELISA檢測(cè)其蛋白水平變化。
　　 (2)通過MTT法檢測(cè)產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌對(duì)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖的影響。
　　 (3)流式細(xì)胞分析技術(shù),檢測(cè)產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌對(duì)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ和共刺激分子(CD40/80/86)等表達(dá)的影響,從而衡量產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌對(duì)抗原

3、提呈細(xì)胞成熟狀態(tài)和功能的影響。
　　 (4)以痤瘡丙酸桿菌為對(duì)照,參考相關(guān)文獻(xiàn),以小鼠為免疫對(duì)象,建立產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌對(duì)OVA(卵清蛋白)或SRBC(綿羊紅細(xì)胞)免疫效應(yīng)影響的試驗(yàn)方法,體內(nèi)試驗(yàn)探討產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌分別在可溶性抗原和顆粒型抗原免疫應(yīng)答中的作用。
　　 (5)ELISA法檢測(cè)不同免疫時(shí)期小鼠體內(nèi)OVA特異性抗體的水平,通過改良溶血空斑試驗(yàn)檢測(cè)免疫小鼠脾臟B細(xì)胞產(chǎn)生抗SRBC的能力,從而研究產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌能

4、否促進(jìn)小鼠產(chǎn)生抗原特異性抗體。
　　 (6)熒光定量PCR法檢測(cè)免疫小鼠脾臟T-bet(Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子)和GATA-3(Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子),流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞中Th1和Th2細(xì)胞所占的比例,ELISA法檢測(cè)血清中IFN-γ和白細(xì)胞介素-4的含量,從不同角度衡量免疫小鼠體內(nèi)的免疫狀態(tài),探討產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌能否促進(jìn)小鼠的抗原特異性免疫應(yīng)答。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與痤瘡丙酸桿菌

5、相比,無論mRNA水平還是蛋白水平,產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌均能更有效地促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生和分泌白細(xì)胞介素-6、TNF-α、白細(xì)胞介素-12等細(xì)胞因子。
　　 (2)MTT增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示,產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌能有效促進(jìn)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖。
　　 (3)流式細(xì)胞分析技術(shù)分析抗原提呈細(xì)胞表面MHCⅡ和共刺激分子(CD40/80/86)表達(dá)情況表明,產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌能明顯增強(qiáng)MHCⅡ和共刺激分子(CD40/80/86)的表達(dá)水

6、平,提示產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌能促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的成熟和抗原提呈活性。
　　 (4)應(yīng)用產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌+OVA和產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌+SRBC聯(lián)合免疫BABL/c小鼠,建立了產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌與抗原聯(lián)合免疫方案,為研究其免疫佐劑功能奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 (5)ELISA檢測(cè)小鼠血清中的OVA特異性抗體水平表明,產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌和OVA聯(lián)合免疫試驗(yàn)組中,OVA抗體水平明顯高于對(duì)照組和痤瘡丙酸桿菌實(shí)驗(yàn)組。在產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌+SRB

7、C聯(lián)合免疫的小鼠,B細(xì)胞產(chǎn)生SRBC特異性抗體的能力增強(qiáng),提示產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌能有效提高BABL/c小鼠對(duì)不同類型抗原的抗體應(yīng)答能力。
　　 (6)在OVA/SRBC免疫小鼠,熒光定量PCR法顯示,產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌處理組小鼠脾臟GATA-3的水平明顯高于T-bet;流式細(xì)胞分析技術(shù)證實(shí)脾臟淋巴細(xì)胞中Th2型細(xì)胞所占的比例升高;ELISA結(jié)果表明,血清中白細(xì)胞介素-4的含量也明顯升高。
　　 研究結(jié)論:
　　 產(chǎn)丙

8、酮酸棒狀桿菌是一種新發(fā)現(xiàn)的棒狀桿菌,是一種無芽孢、無動(dòng)力、需脂的的革蘭染色陽性的棒狀桿菌,至今未發(fā)現(xiàn)其攜帶結(jié)核菌素、白喉毒素等已知的棒狀桿菌毒素及其他致病性。本試驗(yàn)以痤瘡丙酸桿菌為參照,通過體內(nèi)、體外試驗(yàn)研究產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用和作為免疫佐劑的可能性。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),產(chǎn)丙酮酸棒狀桿菌能有效促進(jìn)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子,如炎癥因子白細(xì)胞介素-6和Th1型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-12等,能促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞的增殖,有