黏膜免疫佐劑對雞黏膜和系統(tǒng)免疫反應(yīng)機(jī)理的研究.pdf

1、多數(shù)傳染病通過消化道和呼吸道傳播，研究與實踐證明消化道黏膜免疫不僅在黏膜局部和其它黏膜組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答，還可引起全身性的體液免疫應(yīng)答。但是，由于疫苗經(jīng)過消化道時常受到消化液的降解，在應(yīng)用中不得不增加了抗原的用量，使其在生產(chǎn)推廣中受到一定的限制。近年來發(fā)現(xiàn)黏膜免疫佐劑能提高黏膜局部和系統(tǒng)的抗體水平，但佐劑種類繁多，作用效果各異，不適于推廣應(yīng)用。因此研究佐劑的作用特點和作用機(jī)理，開發(fā)高效、安全的黏膜免疫佐劑已成為亟待解決的問題。本研究選擇大

2、豆黃酮、CpG DNA、重組IL-2、乳酸桿菌和氟化鈉五種不同類型的黏膜免疫佐劑為研究對象，分別與雞新城疫弱毒苗配合口服免疫雞后，系統(tǒng)研究了它們的免疫增強作用和機(jī)理，初步篩選出作用較好的佐劑進(jìn)行配合，研制了兩種新型復(fù)合黏膜免疫佐劑，并對其部分作用機(jī)理進(jìn)行了研究，為口服免疫的推廣和應(yīng)用提供理論依據(jù)。試驗分為以下五章： 1．不同類型黏膜免疫佐劑對雞小腸局部免疫水平和系統(tǒng)免疫的影響 將大豆黃酮、CpG DNA、重組IL-2、乳

3、酸桿菌和氟化鈉五種不同類型的黏膜免疫佐劑，分別與雞新城疫弱毒苗配合口服免疫雞群后，應(yīng)用組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和免疫血清學(xué)方法研究動物黏膜局部和系統(tǒng)免疫水平的變化，初步探討佐劑的作用機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)應(yīng)用大豆黃酮、CpG DNA和重組IL-2與雞新城疫弱毒苗配合口服免疫雞后，小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(iIEL)的數(shù)量從免疫后第五周開始比單獨應(yīng)用新城疫弱毒苗的明顯增加，到第七周時數(shù)量達(dá)最多。(2)添加黏膜免疫佐劑可以有效刺激黏膜局部肥大細(xì)胞的增

4、加，并且其作用具有時間性。不同類型的黏膜免疫佐劑對肥大細(xì)胞的刺激作用也不同。乳酸桿菌對十二指腸肥大細(xì)胞的作用明顯，而CpG DNA對空腸中肥大細(xì)胞的效果最好，CpG DNA和乳酸桿菌對Peyer’s斑處的肥大細(xì)胞作用均明顯高于其它幾種佐劑。(3)大豆黃酮、CpG DNA、重組IL-2和乳酸桿菌在整個免疫期內(nèi)均可顯著增加各段小腸中IgA分泌細(xì)胞數(shù)量，其中乳酸桿菌的效果最好，但是維持時間較短。(4)大豆黃酮和CpG DNA兩種佐劑對黏膜局部

5、SIgA水平都有明顯的促進(jìn)作用，而且持續(xù)作用較長。(5)大豆黃酮、重組IL-2、CpG DNA和氟化鈉四種佐劑都可以顯著提高血清中新城疫特異性抗體水平，增強全身體液免疫力，其中氟化鈉的效果最好。 2．不同類型黏膜免疫佐劑抗原遞呈機(jī)制的研究 為了進(jìn)一步研究黏膜免疫佐劑對局部小腸的免疫機(jī)制，應(yīng)用大鼠腸道原位結(jié)扎灌注模型觀察大豆黃酮、CpG DNA和乳酸桿菌三種黏膜免疫佐劑對樹突狀細(xì)胞和MHC Ⅱ類分子的影響，研究不同類型的佐

6、劑在小腸黏膜中的抗原遞呈方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)CpG DNA和乳酸桿菌能夠顯著增加小腸樹突狀細(xì)胞的數(shù)量，刺激樹突狀細(xì)胞的活性，促進(jìn)局部疫苗抗原的遞呈，有效誘導(dǎo)局部黏膜的特異性免疫應(yīng)答。(2)大豆黃酮、CpG DNA、乳酸桿菌組的大鼠空腸MHC Ⅱ類分子表達(dá)量在24小時內(nèi)顯著增加，表明黏膜免疫佐劑可有效刺激抗原遞呈細(xì)胞對抗原的遞呈。提示黏膜免疫佐劑可以增加樹突狀細(xì)胞的數(shù)量，提高黏膜局部抗原遞呈細(xì)胞MHC Ⅱ類分子的表達(dá)?？乖f呈細(xì)胞的活性

7、增強可以促進(jìn)局部特異性免疫反應(yīng)。 3．不同類型黏膜免疫佐劑對核轉(zhuǎn)錄因子的影響 為了研究黏膜免疫佐劑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，應(yīng)用大鼠腸道原位結(jié)扎灌注模型觀察大豆黃酮、CpG DNA和乳酸桿菌三種黏膜免疫佐劑對轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)CpG DNA可以在24小時內(nèi)顯著增加NF-кB蛋白的表達(dá)量，0.25小時作用最明顯。表明在CpG DNA刺激機(jī)體后激活NF-кB的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞的反應(yīng)，使機(jī)體的非特異性免疫

8、能力明顯增強。(2)乳酸桿菌在6小時內(nèi)可極顯著增加NF-кB蛋白的表達(dá)，表明乳酸桿菌刺激機(jī)體后也可激活NF-кB途徑。(3)大豆黃酮組NF-кB蛋白的表達(dá)不明顯。提示大豆黃酮對機(jī)體的刺激信號可能不通過NF-кB途徑激活局部免疫反應(yīng)。 4．復(fù)合黏膜免疫佐劑對雞局部黏膜免疫和系統(tǒng)免疫的作用和機(jī)理的研究 根據(jù)對不同類型黏膜免疫佐劑免疫效果和作用機(jī)制的研究，選擇大豆黃酮、CpG DNA、乳酸桿菌和氟化鈉配制成兩種復(fù)合黏膜免疫佐劑

9、：大豆黃酮、乳酸桿菌和氟化鈉配合組成復(fù)合佐劑Ⅰ，CpG DNA與氟化鈉配合組成復(fù)合佐劑已Ⅱ已。將兩種復(fù)合佐劑分別與雞新城疫弱毒苗配合口服免疫雞群后，應(yīng)用組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)和免疫血清學(xué)方法觀察動物黏膜局部和系統(tǒng)免疫水平的變化，研究復(fù)合佐劑的免疫增強效果和機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)兩種復(fù)合黏膜免疫佐劑都能增加局部小腸i IEL、CD3<'+>T細(xì)胞和肥大細(xì)胞的數(shù)量，但對IFN-γ mRNA表達(dá)水平影響不大，且在免疫后期IFN-γ

10、mRNA表達(dá)水平呈較低趨勢。表明兩種復(fù)合佐劑都可以有效提高黏膜局部細(xì)胞反應(yīng)，不同腸段兩者效果有差異，復(fù)合佐劑已Ⅱ在空腸效果明顯，維持時間長。(2)兩種復(fù)合黏膜免疫佐劑都可以增加小腸局部IgA分泌細(xì)胞數(shù)量和腸內(nèi)容物中SIgA抗體水平，但對糞便中SIgA抗體水平影響不明顯。表明兩種復(fù)合佐劑都能明顯誘導(dǎo)小腸黏膜局部體液免疫反應(yīng)，作用維持時間較長，在免疫末期作用仍較明顯。(3)應(yīng)用復(fù)合黏膜免疫佐劑可以顯著增加血清中特異性抗體IgG、IgA的效價

11、，表明復(fù)合佐劑與疫苗配合使用后能顯著提高機(jī)體的體液免疫功能，其中復(fù)合佐劑Ⅱ?qū)贵w的維持時間較長。 5．攻毒保護(hù)作用的研究 為了研究復(fù)合佐劑在生產(chǎn)實踐中對雞群的免疫保護(hù)效果，我們將兩種復(fù)合黏膜免疫佐劑分別與新城疫疫苗配合通過口服免疫雞群，當(dāng)檢測雞群最高抗體效價≤41og2時，用新城疫F<,48>E<,2>強毒株模擬自然經(jīng)口感染途徑對雞群進(jìn)行攻擊，探討復(fù)合黏膜免疫佐劑應(yīng)用后對雞群的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩種復(fù)合黏膜免疫佐劑與新

12、城疫疫苗配合免疫的雞在攻毒后第4天有2只出現(xiàn)輕微神精癥狀，其它正常；攻毒后第7天后全部正常，存活率為100％。單獨應(yīng)用新城疫弱毒苗免疫的雞在攻毒后第4天死亡3只，存活率50％；攻毒后第5天死亡2只，存活率16.67％；攻毒后第6天全部死亡；對照組的雞在攻毒后第四天全部死亡。表明抗體水平在臨界保護(hù)線(≤41og2)時，使用添加復(fù)合黏膜免疫佐劑的疫苗免疫，仍然可以有效的保護(hù)雞群，抵抗病毒的感染。提示新型復(fù)合黏膜免疫佐劑免疫效果和抗感染效果確