牙鲆免疫應(yīng)答的溫度效應(yīng)及黏膜免疫分子的研究.pdf

1、近二十年來，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，漁用疫苗的研發(fā)進(jìn)入了快速發(fā)展的階段，給養(yǎng)殖魚類疾病免疫防治帶來了希望。由于免疫防治的效果受到多種因素的影響和控制，所以要達(dá)到理想的病害免疫防治效果，需要考慮魚體自身免疫系統(tǒng)組成特點及免疫應(yīng)答規(guī)律。魚類黏膜免疫系統(tǒng)是魚類抵抗病原入侵的第一道防線，而免疫應(yīng)答受環(huán)境因素尤其溫度的影響非常顯著，因此，深入研究溫度對魚類免疫應(yīng)答的影響規(guī)律及魚類黏膜免疫分子特性、功能是開展魚類病害免疫防治的前提和基礎(chǔ)。

2、
　　 本論文在國家自然科學(xué)基金項目資助下完成，分析了不同溫度下牙鲆系統(tǒng)及黏液免疫應(yīng)答的水平變化；純化分析了牙鲆皮膚黏液免疫球蛋白(Ig)，并制備了其單克隆抗體，應(yīng)用該抗體研究了牙鲆黏液Ig與血清Ig、表面抗體陽性細(xì)胞的關(guān)系；另外克隆了牙鲆多聚免疫球蛋白受體(pIgR)基因cDNA全序列，RT-PCR分析該基因在不同組織內(nèi)的差異表達(dá)情況，并對其進(jìn)行體外表達(dá)，研究了重組蛋白的特性；同時研制出牙鲆pIgR多克隆抗體，并利用該多抗鑒定

3、了皮膚黏液中的受體蛋白，為探討pIgR的特性及功能奠定了基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)牙鲆免疫應(yīng)答的溫度效應(yīng)研究。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)研究了不同水溫(9℃、15℃、21℃和26℃)下用滅活LCDV疫苗腹腔注射牙鲆后的系統(tǒng)免疫應(yīng)答變化，結(jié)果表明，外周血、脾及前腎組織中表面抗體陽性(SmIg+)細(xì)胞比例及血清中抗體水平在21℃下變化最大，低溫(9℃和15℃)時變化緩慢，且峰值水平較低；26℃下

4、峰值低于21℃溫度時峰值。同時應(yīng)用ELISA檢測了皮膚黏液中特異性抗體水平的變化，分析了溫度對牙鲆皮膚黏液抗體產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，皮膚黏液中特異性抗體水平在21℃水溫下OD值上升最快，且達(dá)峰值時間最早；低溫(9℃和15℃)時變化緩慢，且峰值水平較低。以上結(jié)果說明牙鲆免疫應(yīng)答與溫度密切相關(guān)，在最適溫度21℃時變化最大，低溫或高溫時免疫應(yīng)答受抑制。
　　 (2)黏液Ig的分離純化。采用飽和硫酸銨分步鹽析牙鲆黏液后，應(yīng)用AKTA p

5、rime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，通過凝膠柱Sephacryl S-300、HiTrap DEAE Sepharose Fast FlowColumn兩種預(yù)裝層析柱純化牙鲆黏液Ig，并進(jìn)行了分子量的初步測定。結(jié)果表明，飽和硫酸銨分步鹽析、Sephacryl S-300和DEAE Sepharose Fast Flow Column三種方法結(jié)合可特異性的分離牙鲆黏液Ig，純度高，變性電泳SDS-PAGE檢測分析得出純化獲得牙鲆黏液Ig的重鏈和輕鏈分

6、子量分別為72 kDa和26 kDa，非變性電泳Native-PAGE結(jié)果顯示純化的牙鲆黏液Ig分子量為798 kDa。
　　 (3)抗牙鲆黏液Ig單克隆抗體的制備及應(yīng)用。以純化的牙鲆黏液Ig為抗原免疫Balb/C小鼠，采用單克隆抗體技術(shù)獲得了8株抗牙鲆黏液Ig的單克隆抗體(1A-M2、1C-M10、1E-M2、1F-M7、3F-M9、3G-M5、8B-M4、BE-MS)。Western blotting結(jié)果顯示：8株單抗識別的

7、抗原決定簇均位于牙鲆黏液Ig的重鏈(72kDa)上。應(yīng)用抗牙鲆黏液Ig單抗(1A-M2)及之前實驗室制備的抗血清Ig單抗2D8，通過流式細(xì)胞術(shù)同時分析了牙鲆各組織中的SmIg+細(xì)胞的比例，1A-M2孵育結(jié)果分別為外周血細(xì)胞(38.64％)，脾(23.6％)，皮膚(16.56％)和鰓(6.26％)，2D8孵育結(jié)果分別為外周血細(xì)胞(48.89％)，脾(33.7％)，皮膚(15％)和鰓(6.02％)，說明抗牙鲆黏液Ig單抗及抗血清Ig單抗均可

8、與SmIg+細(xì)胞反應(yīng)，黏液Ig與血清Ig至少具有部分抗原相似性：另外應(yīng)用制備的1A-M2及抗血清Ig單抗2D8通過Western blotting分析牙鲆黏液Ig及血清Ig抗原性差異，結(jié)果表明1A-M2只與黏液Ig反應(yīng)，不與血清Ig反應(yīng)，而單抗2D8可與黏液Ig與血清Ig反應(yīng)，說明黏液Ig與血清Ig存在抗原性差異。
　　 (4)牙鲆pIgR基因cDNA序列的克隆、表達(dá)及特性分析。通過RACE技術(shù)獲得pIgR cDNA序列，全長1

9、384 bp，含一個1005 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼335氨基酸，蛋白分子量大小為37.6 kDa。同時，利用半定量RT-PCR分析了pIgR基因在牙鲆不同組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄差異情況，結(jié)果顯示該基因在腸、肝臟、鰓和皮膚中表達(dá)量最高，脾和前腎次之，在胃和肌肉中轉(zhuǎn)錄水平最低，說明該基因與牙鲆黏液Ig轉(zhuǎn)運密切相關(guān)。同時成功地構(gòu)建了表達(dá)牙鲆pIgR ORF的重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)后，得到包涵體形式的pIgR重組蛋白(rpIgR)，分子量為58