雞IBV感染對(duì)氣管黏膜固有免疫相關(guān)基因表達(dá)影響的初步研究.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是給養(yǎng)雞業(yè)帶來很大經(jīng)濟(jì)損失的一種急性高度接觸傳染性呼吸道疾病，是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的。IBV屬典型的嗜黏膜病原，其通過呼吸道黏膜途徑侵入機(jī)體后，擴(kuò)散到全身，引起機(jī)體廣泛部位的黏膜上皮細(xì)胞損傷。因此開展IBV黏膜免疫研究的重要性無容置疑。
　　 IBV致病機(jī)制研究是IB預(yù)防控制的主要方向之一

2、，黏膜免疫研究是IBV致病機(jī)制研究的重中之重。固有免疫在機(jī)體非特異性抗感染免疫過程、特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)、調(diào)節(jié)和效應(yīng)階段發(fā)揮著重要作用。目前有關(guān)雞IBV感染對(duì)氣管黏膜固有免疫相關(guān)基因表達(dá)影響的研究比較欠缺。
　　 本研采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測IBV廣西變異株分離株GX-YL5感染健康陰性雞后1、3、5、8和12d雞氣管黏膜模式識(shí)別受體(TLR2、TLR3、TLR6、TLR7)、細(xì)胞因子(IL-1β

3、、IL-6、IL-10、IFN-α、IFN-β、Mx)、趨化因子與免疫細(xì)胞運(yùn)輸因子(CXCR4、CCR6、MMP3、MIP-1β)共14個(gè)固有免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)，同時(shí)在5個(gè)候選內(nèi)參基因ACTB、TBP、GAPDH、18S rRNA和28S rRNA中進(jìn)行最佳內(nèi)參基因選擇的研究。
　　 根據(jù)GenBank上TLR2、TLR6、TLR7、IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-β、CXCR4、CCR6、MMP3和MIP-

4、1β mRNA的基因序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成了各自的特異引物；TLR3、IFN-α、Mx、ACTB、TBP、GAPDH、18S rRNA和28S rRNA參考已發(fā)表的引物。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，分別擴(kuò)增出19個(gè)基因的目的片段，PCR回收純化的產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行熔解曲線分析。結(jié)果顯示，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線相關(guān)系數(shù)R2均大于0.992，且擴(kuò)增效率在94％-102％之間；熔解曲線分析

5、結(jié)果顯示所建立的方法特異性好，溶解曲線均出現(xiàn)單特異峰。
　　 應(yīng)用已建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因ACTB、TBP、GAPDH、18S rRNA和28S rRNA在IBV(GX-YL5)感染后不同時(shí)相雞的氣管黏膜中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。然后用geNorm、NormFinder、BestKeeper和比較△Ct共4種分析方法對(duì)熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出基因的表達(dá)穩(wěn)定值。最終篩選出ACTB、GAPDH和TBP

6、作為合適的內(nèi)參基因，用于校正IBV(GX-YL5)感染后不同時(shí)相雞氣管黏膜中其它目的基因的差異表達(dá)。
　　 應(yīng)用已建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，對(duì)IBV(GX-YL5)感染健康陰性雞后1、3、5、8和12d雞氣管黏膜模式識(shí)別受體(TLR2、TLR3、TLR6、TLR7)、細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-α、IFN-β、Mx)、趨化因子與免疫細(xì)胞運(yùn)輸因子(CXCR4、CCR6、MMP3、MIP-1β)共14

7、個(gè)固有免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行了檢測。并以ACTB、TBP和GAPDH作為內(nèi)參基因，用pfaffl法進(jìn)行相對(duì)定量分析。結(jié)果表明攻毒后1d，MX、TLR2和TLR7的mRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)；攻毒后3d，CXCR4和MIP-1β的mRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，IFN-β的mRNA表達(dá)上調(diào)更為明顯；攻毒后5d，IL-1β的mRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，IFN-β的mRNA表達(dá)上調(diào)最為明顯；攻毒后8d，IL-1β和MIP-1β的mRNA表達(dá)出

8、現(xiàn)明顯上調(diào)；攻毒后12d，TLR2和IL-6的mRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)；其中IFN-β在攻毒后3和5d差異性表達(dá)極為顯著，分別高達(dá)97.51倍和165.54倍。提示IFN-β在抗IBV感染早期的固有免疫應(yīng)答中可能發(fā)揮重要的作用。
　　 本研究獲得IBV(GX-YL5)感染后雞氣管黏膜固有免疫相關(guān)基因表達(dá)動(dòng)態(tài)的初步資料，從分子水平解析了雞IBV感染對(duì)氣管黏膜的固有免疫的影響作用和途徑，揭示雞IBV感染對(duì)氣管黏膜固有免疫作用的分子機(jī)