不同來源人牙周膜干細(xì)胞的生物特性.pdf

1、牙周炎是牙周組織的感染性疾病，包括牙周膜，牙骨質(zhì)，牙槽骨，牙齦的破壞。牙周病治療的終極目標(biāo)是阻止進(jìn)一步的附著喪失和獲得牙周軟硬組織的再生。近年來，施松濤等發(fā)現(xiàn)了牙周膜干細(xì)胞，應(yīng)用牙周膜干細(xì)胞治療牙周病提供了新思路。牙周組織中的炎癥變化是否影響其中的干細(xì)胞？不同年齡人牙周膜干細(xì)胞是否表現(xiàn)不同生物特性？牙根表面和牙槽窩內(nèi)殘留的牙周膜干細(xì)胞在分化程度和功能方面是否有所不同？對于這些問題的回答，無疑將有助于更加深入地理解牙周組織的發(fā)育過程和牙周

2、炎機(jī)理，也將為今后牙周組織再生選擇種子細(xì)胞打下理論基礎(chǔ)。
　　本課題的研究內(nèi)容如下：
　　第一部分：年齡及其微環(huán)境對牙周膜干細(xì)胞生物特性的影響
　　目的：探討年齡及其微環(huán)境是否影響牙周膜干細(xì)胞的增殖與分化。方法：年輕組牙周膜干細(xì)胞與年老牙周膜細(xì)胞條件液共培養(yǎng)，年老組牙周膜干細(xì)胞與年輕牙周膜細(xì)胞條件液共培養(yǎng)，使用倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩種細(xì)胞的表面分子表達(dá)，細(xì)胞增殖檢測（克隆形成能力及細(xì)胞周期分

3、析）、多向分化（成骨和成脂）能力檢測、實(shí)時定量RT-PCR檢測、將細(xì)胞與陶瓷骨（CBB）復(fù)合，移植入裸鼠皮下6周后取材，組織學(xué)觀察。結(jié)果：流式細(xì)胞檢測的結(jié)果表明，年輕組Stro-1和CD146的表達(dá)明顯高于年老組，倒置相差顯微鏡觀察年輕組人牙周膜干細(xì)胞貼壁伸展后細(xì)胞呈長梭形，突起少體積較小，胞體豐滿，胞質(zhì)顆粒少。年老組細(xì)胞大多數(shù)長梭形,顯示較大的伸展形態(tài)，胞體不豐滿，胞質(zhì)顆粒多。經(jīng)年老牙周膜細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的年輕人牙周膜干細(xì)胞胞體變長

4、，突起增多。經(jīng)年輕牙周膜細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的年老人牙周膜干細(xì)胞胞體變小，突起減少。年輕組細(xì)胞克隆形成能力明顯高于年老組。年老牙周膜干細(xì)胞條件培養(yǎng)液降低年輕人牙周膜干細(xì)胞的克隆形成能力，年輕牙周膜細(xì)胞條件培養(yǎng)液提高年老人牙周膜干細(xì)胞的克隆形成能力。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析，年輕組人牙周膜干細(xì)胞S+G2M期明顯高于年老組，年老牙周膜干細(xì)胞條件培養(yǎng)液降低年輕人牙周膜干細(xì)胞的細(xì)胞周期，年輕牙周膜細(xì)胞條件培養(yǎng)液提高年老人牙周膜干細(xì)胞的細(xì)胞周

5、期。年輕組人牙周膜干細(xì)胞體外礦化，成脂能力明顯強(qiáng)于年老組。年老牙周膜干細(xì)胞條件培養(yǎng)液降低年輕人牙周膜干細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)，脂肪面積，年輕牙周膜細(xì)胞條件培養(yǎng)液提高年老人牙周膜干細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)，脂肪面積。年輕組人牙周膜干細(xì)胞Runx2，CollagentypeI，Osteocalcin的表達(dá)明顯高于年老組。年老牙周膜細(xì)胞條件培養(yǎng)液降低年輕人牙周膜干細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)，年輕牙周膜細(xì)胞條件培養(yǎng)液提高年老人牙周膜干細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)。年輕組人

6、牙周膜干細(xì)胞移植物顯示出在CBB表面有牙骨質(zhì)和牙周纖維樣組織形成，而年老牙周膜干細(xì)胞移植物形成的大部分是纖維組織，CBB表面有少量礦化物形成。年輕人牙周膜干細(xì)胞經(jīng)年老牙周膜細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后形成的大部分是纖維組織，CBB表面礦化物很少。年老人牙周膜干細(xì)胞經(jīng)年輕牙周膜細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后在CBB表面形成的礦化組織多于年老人牙周膜干細(xì)胞組。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次在體外模擬牙周膜干細(xì)胞發(fā)育微環(huán)境，年齡影響牙周膜干細(xì)胞的增殖與分化，牙周

7、膜干細(xì)胞的活性可被外界因素調(diào)節(jié)。
　　第二部分：牙周炎癥對牙周膜干細(xì)胞生物特性的影響
　　目的：探討牙周炎癥是否影響牙周膜干細(xì)胞的增殖與分化。方法：分離、培養(yǎng)健康和牙周炎癥感染牙周膜干細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩種細(xì)胞的表面分子表達(dá)、細(xì)胞增殖檢測（MTT、克隆形成能力及細(xì)胞周期分析）、多向分化（成骨和成脂）能力檢測、實(shí)時定量RT-PCR檢測、ALP活性檢測、將細(xì)胞與陶瓷骨（CBB）復(fù)合，移植入裸鼠皮下6周后取材，組織學(xué)觀察。結(jié)

8、果：流式細(xì)胞檢測的結(jié)果表明，炎癥組Stro-1的表達(dá)明顯高于健康組。炎癥組細(xì)胞克隆形成能力明顯高于健康組。流式細(xì)胞檢測的結(jié)果表明，炎癥組人牙周膜干細(xì)胞S+G2M期明顯高于健康組，健康組人牙周膜干細(xì)胞體外礦化，成脂能力明顯強(qiáng)于炎癥組。健康組人牙周膜干細(xì)胞Runx2，CollagentypeI，Osteocalcin的表達(dá)以及ALP活性明顯高于炎癥組。健康組人牙周膜干細(xì)胞移植物顯示出在CBB表面有牙骨質(zhì)和牙周纖維樣組織形成，牙骨質(zhì)樣細(xì)胞陷在

9、礦化結(jié)構(gòu)中；而炎癥組牙周膜干細(xì)胞移植物形成的大部分是纖維組織，CBB表面有少量礦化物形成。結(jié)論：牙周炎癥影響牙周膜干細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖與分化能力。
　　第三部分：分離部位對牙周膜干細(xì)胞生物特性的影響
　　目的：探討分離部位是否影響牙周膜干細(xì)胞生物特性。方法：分離、培養(yǎng)牙根表面和牙槽窩內(nèi)的牙周膜干細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩種細(xì)胞的表面分子表達(dá)、細(xì)胞增殖檢測（MTT、克隆形成能力及細(xì)胞周期分析）、多向分化（成骨和成脂）能力檢

10、測、實(shí)時定量RT-PCR檢測、ALP活性檢測、將細(xì)胞與陶瓷骨（CBB）復(fù)合，移植入裸鼠皮下6周后取材，組織學(xué)觀察。結(jié)果：牙根表面的牙周膜干細(xì)胞克隆形成能力明顯高于牙槽窩內(nèi)的牙周膜干細(xì)胞。流式細(xì)胞檢測的結(jié)果表明，牙根表面的牙周膜干細(xì)胞S+G2M期明顯高于牙槽窩內(nèi)的牙周膜干細(xì)胞。牙槽窩內(nèi)的牙周膜干細(xì)胞體外礦化能力明顯強(qiáng)于牙根表面的牙周膜干細(xì)胞，成脂沒有差異。牙槽窩內(nèi)的牙周膜干細(xì)胞人牙周膜干細(xì)胞Runx2，CollagentypeI，Oste