兩種不同來源的細(xì)胞外基質(zhì)微粒支架對人脂肪源性干細(xì)胞體內(nèi)成脂能力的影響.pdf

1、皮下軟組織充填是整形外科常見的治療手段。對于體表的皮下軟組織缺損，凹陷萎縮畸形目前常采用自體游離脂肪或各種人工材料進(jìn)行充填。人工材料因存在排異反應(yīng)及安全性問題難以滿足臨床需要，而自體游離脂肪的移植存活率低。脂肪移植物被吸收的原因總結(jié)起來可分為兩種：一是成熟脂肪細(xì)胞對缺氧損傷的耐受力低，且不容易增殖更新；其二是由于移植脂肪組織的血供不足，導(dǎo)致移植到供區(qū)的脂肪因缺氧而壞死，產(chǎn)生硬結(jié)液化。以干細(xì)胞為種子細(xì)胞，應(yīng)用組織工程的方法構(gòu)建脂肪組織，已

2、成為目前人們研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)在應(yīng)用較多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但由于其取材困難，來源有限而受到一定限制。最近人們從脂肪組織中分離提取出具有干細(xì)胞作用的一種細(xì)胞類型，稱為脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ASCs)，它具有取材便利、創(chuàng)傷小，不會(huì)引起倫理學(xué)爭議等優(yōu)點(diǎn)，成為應(yīng)用前景廣泛的一種可用于自體組織修復(fù)和重建的種子細(xì)胞。
　　 除了種子細(xì)胞外，尋找一種適合脂肪組織工程的支架材料也是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。細(xì)胞外

3、基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是由生物大分子構(gòu)成的錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。在體內(nèi)為細(xì)胞的生存及活動(dòng)提供適宜的環(huán)境，并通過與細(xì)胞黏附分子、調(diào)節(jié)因子和連接蛋白等一系列與細(xì)胞生存、發(fā)育和代謝相關(guān)的細(xì)胞因子的相互作用，影響細(xì)胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化。ECM支架材料的種屬差異小，抗原性較弱，移植后不易產(chǎn)生排斥反應(yīng)。將脫細(xì)胞ECM移植于組織缺損區(qū)后，可為細(xì)胞提供適宜其生存的三維空間和促進(jìn)移植物新生血管化的建立，有利于

4、細(xì)胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氣體交換并排除廢物，并且可作為自體細(xì)胞生長框架，誘導(dǎo)自體細(xì)胞長入其內(nèi)。ECM支架的組織來源有：小腸粘膜下基質(zhì)、血管、皮膚、神經(jīng)、骨骼肌和膀胱等。而研究較多的是豬小腸來源的小腸粘膜下層(smallintestinal submucosa，SIS)。SIS是天然細(xì)胞外基質(zhì)類生物衍生材料，主要成分為Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維，還含有多種生長因子，如FGF-2、TGF-β和VEGF等。SIS免疫原性低，有抗微生物活性，有良好的

5、細(xì)胞相容性，可促進(jìn)多種細(xì)胞在材料上的黏附、生長和分化。SIS植入宿主體內(nèi)后，能迅速誘導(dǎo)細(xì)胞浸潤，刺激血管生成和宿主細(xì)胞的長入與分化，由此產(chǎn)生的再生組織在結(jié)構(gòu)和功能上均與原位組織相似。目前，SIS主要用于血管、肌腱、韌帶、骨膜和膀胱等組織的修復(fù)。
　　 作為組織工程的支架材料，ECM具有良好的生物相容性和可降解性，但目前該支架材料主要來源是動(dòng)物或人尸體，這就容易產(chǎn)生免疫原性問題和病原菌傳播的危險(xiǎn)。脂肪組織是遍布人體的一種結(jié)締組織，

6、具有能量儲(chǔ)存、緩沖作用、絕緣作用等獨(dú)特的功能。脂肪組織主要由充滿脂滴的脂肪細(xì)胞組成，還有其它的細(xì)胞成分包括：成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血細(xì)胞和脂肪源性干細(xì)胞。除此以外，在脂肪組織中還有重要的ECM成分，如膠原、網(wǎng)狀纖維、彈性纖維、神經(jīng)纖維、血管基質(zhì)和淋巴結(jié)等物質(zhì)，以及含有內(nèi)分泌功能的細(xì)胞因子。最近有研究證實(shí)將脂肪組織通過不同的脫細(xì)胞方法制備成的三維支架，不僅保留了大部分細(xì)胞外基質(zhì)成分，而且可以促進(jìn)ASCs的粘附、增殖和成脂分化。

7、既ECM構(gòu)建了一種有利于干細(xì)胞活化的微環(huán)境，以保證干細(xì)胞的再生功能。由于脂肪組織具有來源豐富，只需通過吸脂術(shù)等簡單的手術(shù)即可獲得，安全性高，更重要的是不存在免疫排斥反應(yīng)和倫理學(xué)問題。
　　 本實(shí)驗(yàn)分別用豬小腸和人脂肪抽吸術(shù)后的脂肪組織，制備兩種不同來源的ECM支架，制備成粉末狀，分別構(gòu)建SIS和AT-ECM微粒支架。觀察兩種材料的脫細(xì)胞潔凈度和形態(tài)結(jié)構(gòu)。從脂肪抽吸術(shù)后的脂肪組織中提取分離脂肪源性干細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后，從細(xì)胞生

8、長動(dòng)力學(xué)、形態(tài)學(xué)、增殖分化能力和表面標(biāo)記物等諸多方面探究其生物學(xué)特性。將人的ASCs與兩種微粒支架材料體外復(fù)合后，觀察種子細(xì)胞在兩種材料上的粘附和生長情況。并將與細(xì)胞復(fù)合后的SIS和AT-ECM微粒支架注射到裸鼠體內(nèi)，比較兩種材料對ASCs粘附、增殖和成脂分化能力的影響。以期為再生醫(yī)學(xué)和組織工程器官替代物，尤其是脂肪組織工程器官生物產(chǎn)品提供一種功能更有效使用更方便的器官移植的人工支架材料。
　　 一、材料
　　 材料與方

9、法
　　 (一)組織材料
　　 人脂肪組織來自8例行腹部脂肪抽吸術(shù)的健康成年女性患者，年齡24-47歲，平均35.13±7.62歲，無傳染病和內(nèi)分泌疾病。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)中心，豬小腸空腸段來自沈陽市肉聯(lián)加工廠
　　 (三)實(shí)驗(yàn)材料
　　 低糖DMEM、胎牛血清(Gibco)，Ⅰ型膠原酶、異丁基甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、吲哚美辛、β-甘油磷酸

10、鈉、油紅O(Sigma)，CD31-FITC、CD45-FITC、CD34-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD49d-PE、CD106-PE單克隆抗體(eBioscience)，細(xì)胞周期檢測試劑盒(凱基生物)，Real time PCR試劑盒(TaKaRa)。
　　 二、方法
　　 (一)人脂肪源性干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 將吸脂術(shù)后脂肪組織用膠原酶消化法，分離培養(yǎng)脂肪源性干細(xì)胞。相差顯微鏡觀察細(xì)胞

11、形態(tài)，MTT法測定P3、P9、P15、P20代的細(xì)胞生長活性；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期和表面抗原表達(dá)；成脂成骨誘導(dǎo)后分別行油紅O和茜素紅染色定性。
　　 (二)兩種細(xì)胞外基質(zhì)微粒支架(SIS，AT-ECM)的制備特性及體外相容性觀察
　　 取豬小腸的空腸段，用物理方法和化學(xué)方法制備SIS，取吸脂術(shù)后的脂肪組織用酶消化法和機(jī)械方法制備AT-ECM，組織學(xué)染色和掃描電鏡觀察其結(jié)構(gòu)及脫細(xì)胞情況；將兩種材料制備成粉術(shù)狀后與ASCs

12、進(jìn)行復(fù)合，用MTT和掃描電鏡方法觀察兩種微粒支架與種子細(xì)胞的相容性。
　　 (三)兩種細(xì)胞外基質(zhì)微粒支架(SIS，AT-ECM)體內(nèi)成脂分化觀察和比較
　　 將脂肪源性干細(xì)胞與SIS、AT-ECM微粒支架材料體外復(fù)合，注射入裸鼠背部皮下，以不與基質(zhì)微粒支架材料復(fù)合的單純ASCs植入做為對照，分別于注射后4周和8周時(shí)取出，行HE染色、油紅O染色和Real time PCR技術(shù)檢測細(xì)胞在兩種材料中的成脂分化結(jié)果，并進(jìn)行比較。

13、
　　 結(jié)果
　　 一、人脂肪源性干細(xì)胞的生物學(xué)特性
　　 人脂肪源性干細(xì)胞在形態(tài)上類似成纖維細(xì)胞，呈漩渦狀生長；MTT檢測結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的ASCs傳至15代仍有較強(qiáng)的增殖活性，之后逐漸減慢，至20代時(shí)細(xì)胞增殖速度明顯降低；細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)ASCs具有干細(xì)胞的特性；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD90、CD44表達(dá)陽性，造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34、血細(xì)胞標(biāo)記CD45、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31表達(dá)均為陰性，另外

14、，CD49d低表達(dá)，CD106表達(dá)陰性；成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)可見大量脂滴形成，油紅O染色陽性；成骨誘導(dǎo)后鏡下可見鈣結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色陽性。
　　 二、SIS和AT-ECM微粒支架的結(jié)構(gòu)和體外相容性結(jié)果
　　 兩種材料凍干粉碎后呈粉末狀，HE染色未見藍(lán)染的細(xì)胞核及殘留的細(xì)胞或細(xì)胞碎片。Masson染色顯示脫細(xì)胞后的主要成分為膠原纖維，還有少量的肌纖維。掃描電鏡觀察兩種支架材料主要由膠原纖維構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，SIS網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)更為

15、完整；ASCs與兩種材料的體外復(fù)合實(shí)驗(yàn)說明SIS和AT-ECM微粒支架都能促進(jìn)種子細(xì)胞的粘附和生長，但后者作用更明顯。
　　 三、ASCs在兩種微粒支架上的體內(nèi)成脂分化結(jié)果
　　 兩種不同的支架材料體內(nèi)植入4周和8周取材，各組都有肉眼可見的新生組織形成，大體觀察呈黃色，柔軟，接近人體脂肪組織，新生組織濕重統(tǒng)計(jì)分析各組間無顯著性差異(P>0.05)。HE染色可見脂肪細(xì)胞形成，胞內(nèi)有較大脂滴，細(xì)胞核偏于一側(cè)，細(xì)胞間可見疏松結(jié)

16、締組織分隔。但是只有AT-ECM組發(fā)現(xiàn)其具有血管成分，油紅O染色陽性，8周時(shí)較為明顯。SIS組油紅O染色弱陽性，而ASCs組則為陰性。Real time PCR檢測結(jié)果顯示AT-ECM組中成脂分化相關(guān)基因PPARγ2、LPL和Leptin呈高表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 人脂肪抽吸物經(jīng)酶消化法能分離出具有成纖維細(xì)胞形態(tài)的干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下能保持穩(wěn)定的增殖，表達(dá)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的表面抗原

17、，在誘導(dǎo)因子的作用下能向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化。
　　 應(yīng)用物理和化學(xué)方法能成功的對豬空腸進(jìn)行脫細(xì)胞處理，制備SIS微粒支架，它是一種主要由膠原纖維組成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。應(yīng)用機(jī)械方法和酶消化方法對人脂肪組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理有效，制備成功的AT-ECM微粒支架在形態(tài)學(xué)上與SIS相似，也是由膠原纖維組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與ASCs復(fù)合培養(yǎng)結(jié)果表明：AT-ECM和SIS都能促進(jìn)細(xì)胞的粘附增殖，前者的作用更明顯。
　　 裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯