四環(huán)素類污染物毒性的微觀機(jī)制研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，它與各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起，機(jī)體中的每一個(gè)細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。細(xì)胞是生物有機(jī)體進(jìn)行新陳代謝活動(dòng)的基本單位，外環(huán)境中的有害因子，如物理性因子（電離輻射、噪聲、紫外線等）、化學(xué)性因子和生物性因子（細(xì)菌、病毒等）等，通過不同途徑（如呼吸道、消化道、皮膚及傷口等）作用于機(jī)體，能誘發(fā)機(jī)體結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變，而這些改變無不反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的變化。細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的改變是機(jī)體受到外源性有害物質(zhì)作用所

2、致?lián)p傷的基礎(chǔ)。
　　 四環(huán)素類藥物在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中有廣泛應(yīng)用。由于生物利用率較低，50-80％的四環(huán)素類藥物未經(jīng)代謝而進(jìn)入環(huán)境成為污染物。殘留在土壤、地表水、地下水、甚至飲用水等環(huán)境以及動(dòng)物源食品（如蛋、奶、肉等）中的四環(huán)素類污染物能經(jīng)由食物鏈或以飲食方式進(jìn)入人體，對人類健康形成威脅。四環(huán)素類藥物殘留的污染問題及其毒性已引起了世界范圍內(nèi)的關(guān)注，并已有大量相關(guān)報(bào)道，但國內(nèi)外已有的研究成果還不能徹底闡釋環(huán)境中藥物殘留對生態(tài)及人

3、類健康的內(nèi)在作用機(jī)制。本論文在已報(bào)道的相關(guān)研究成果的基礎(chǔ)上，以四環(huán)素類污染物致機(jī)體毒性的作用靶點(diǎn)功能蛋白質(zhì)和細(xì)胞為對象，研究了常見四環(huán)素類污染物（土霉素OTC、四環(huán)素TC和金霉素CTC，TCs）毒性的微觀機(jī)制，得到以下研究結(jié)果:
　　 1、OTC和TC與血清白蛋白相互作用的機(jī)理研究
　　 血清白蛋白是各種內(nèi)源性和外源性化合物在血液中運(yùn)輸?shù)妮d體。本文在利用公式校正熒光內(nèi)濾效應(yīng)的基礎(chǔ)上研究了OTC和TC與血清白蛋白（BSA和

4、HSA）的相互作用。分子探針的研究結(jié)果表明，OTC和TC與位于血清白蛋白子域ⅢA的位點(diǎn)Ⅱ結(jié)合。計(jì)算得到的△(H)和△(S)分別為負(fù)值和正值，說明OTC和TC與血清白蛋白非共價(jià)結(jié)合的主要作用力為靜電作用力。利用分子模擬方法進(jìn)一步確定OTC和TC的結(jié)合位置為位于位點(diǎn)Ⅱ的正電荷氨基酸殘基（對于BSA為ARG433或ARG436，對于HSA為ARG410或LYS414）。紫外可見吸收光譜、同步熒光光譜和圓二色譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)合的OTC和TC

5、導(dǎo)致血清白蛋白的二級結(jié)構(gòu)和色氨酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變。相關(guān)研究結(jié)果已分別發(fā)表在Biomacromolecules和JournalofAgriculturalandFoodChemistry上。
　　 2、TCs與其毒性相關(guān)的功能蛋白酶的作用機(jī)理研究
　　 已有研究結(jié)果表明，TCs能使過氧化氫酶、溶菌酶和胰蛋白酶等功能蛋白酶的活性下降。本文利用光譜學(xué)技術(shù)結(jié)合分子對接研究了TCs毒性的微觀機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)OTC以一個(gè)

6、結(jié)合位點(diǎn)通過范德華力和氫鍵作用力與過氧化氫酶作用形成復(fù)合物。結(jié)合的OTC使過氧化氫酶的二級結(jié)構(gòu)和色氨酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變，使過氧化氫酶活性受到抑制;(2)OTC、TC和CTC以一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與位于溶菌酶表面裂縫的活性中心中的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基(Glu35或Asp52)作用，競爭性抑制溶菌酶活性，結(jié)合強(qiáng)度的順序?yàn)?CTC＞TC＞OTC。分子對接和熱力學(xué)分析的結(jié)果均表明，靜電作用力在TCs與溶菌酶的作用過程中占主導(dǎo)地位。結(jié)合的TCs使溶菌酶的

7、二級結(jié)構(gòu)和色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變。(3)OTC、TC和CTC均能以一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與胰蛋白酶通過范德華力和氫鍵作用力作用形成復(fù)合物，結(jié)合強(qiáng)度的順序?yàn)?TC＞OTC＞CTC。結(jié)合的TCs能抑制胰蛋白酶活性，抑制程度大小順序?yàn)?CTC＞OTC＞TC。分子對接和胰蛋白酶活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均表明OTC和TC與胰蛋白酶的S1結(jié)合口袋結(jié)合，競爭性抑制酶活性;由于在CTC苯環(huán)上的氯原子阻礙苯環(huán)進(jìn)入S1結(jié)合口袋，CTC與胰蛋白酶的非酶活性中心位點(diǎn)結(jié)合，非競

8、爭性抑制胰蛋白酶活性。結(jié)合的TCs使胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)和色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變，但不同的結(jié)合位置使CTC對胰蛋白酶二級結(jié)構(gòu)的影響與OTC和TC相反。相關(guān)工作已分別發(fā)表在ScienceofTheTotalEnvironment,Chemosphere和PLoSONE上。
　　 3、TCs對人血紅細(xì)胞毒性的作用機(jī)理研究
　　 常見的TCs（OTC和TC）均能進(jìn)入紅細(xì)胞，本文考察了其對紅細(xì)胞毒性的微觀作用機(jī)理。研究結(jié)果表明

9、:(1)OTC能引起紅細(xì)胞抗氧化防御體系功能下降，導(dǎo)致紅細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致以下毒性效應(yīng):使紅細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，并進(jìn)一步導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血（OTC濃度大于8×10-5molL-1）。在低濃度下(≤4×10-5molL-1)，OTC能使紅細(xì)胞ATP酶活性增強(qiáng);隨濃度進(jìn)一步增大，OTC能抑制ATP酶活性，影響細(xì)胞功能;(2)利用流式細(xì)胞術(shù)探索性建立反映紅細(xì)胞抗氧化性的指標(biāo)（谷胱甘肽和活性氧）的檢測方法，并考察了TC對其含量的影響。結(jié)果表明，TC

10、能導(dǎo)致紅細(xì)胞谷胱甘肽含量減少，從而使細(xì)胞抗氧化防御體系功能降低，導(dǎo)致細(xì)胞氧化/抗氧化平衡穩(wěn)態(tài)被破壞，進(jìn)而使ROS濃度升高，造成氧化應(yīng)激，能引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷;(3)OTC和TC均以一個(gè)作用位點(diǎn)與血紅蛋白通過范德華力和氫鍵作用力結(jié)合形成復(fù)合物。同步熒光實(shí)驗(yàn)和分子對接均表明，OTC和TC在血紅蛋白上的結(jié)合位置為四個(gè)亞基之間的中央空穴。結(jié)合的OTC和TC能改變血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和酪氨酸殘基的微環(huán)境。部分研究結(jié)果已經(jīng)在JournalofHaz