近江牡蠣貝肉高F值寡肽酶法制備的研究.pdf

1、為了提高牡蠣產(chǎn)品的附加值，擬利用近江牡蠣(Ostrea rivularis Gould)貝肉制備高F值寡肽。本研究通過胰酶酶解近江牡蠣貝肉，運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)考察底物濃度、酶濃度、溫度、pH值及酶解時(shí)間對水解度的影響，并進(jìn)一步研究水解產(chǎn)物中芳香族氨基酸及寡肽含量變化與水解度的相關(guān)性，從而確定一個比較簡單可行的觀測指標(biāo)。利用該指標(biāo)，應(yīng)用響應(yīng)面分析法確定酶解工藝條件。而后，在此基礎(chǔ)上研究吸附法和凝膠過濾層析法對酶解產(chǎn)物中芳香族氨基酸的去除效果，

2、最終確定一種有效去除酶解產(chǎn)物中芳香族氨基酸的方法，以達(dá)到制備牡蠣高F值寡肽的目標(biāo)。 研究主要結(jié)果如下： 1、單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：底物濃度(5～30％)、酶濃度(5000～30000U/g蛋白)、溫度(35～60℃)、pH值(3.00～10.0)及酶解時(shí)間(1～12h)對水解度均有影響。其中分別在底物濃度約為20％、溫度50℃、pH值8.00時(shí)，水解度均呈現(xiàn)峰值；而酶濃度與酶解時(shí)間對水解度的影響相似，隨著它們的增加或延長，

3、水解度均呈快速上升趨勢，當(dāng)它們增加或延長達(dá)到一定程度(酶濃度15000U/g蛋白或酶解時(shí)間4h)后，水解度上升趨勢不明顯。 2、水解產(chǎn)物中芳香族氨基酸及寡肽含量變化與水解度的相關(guān)性結(jié)果表明：酶解液中芳香族氨基酸和寡肽含量的變化趨勢與水解度的變化基本一致。由于水解度的測定方法實(shí)驗(yàn)周期短，操作簡單，而且其變化趨勢又能間接地反映出胰酶解牡蠣貝肉的酶解產(chǎn)物中芳香族氨基酸和寡肽含量的變化，故在制備牡蠣貝肉高F值寡肽過程中，水解度可作為觀測

4、水解產(chǎn)物的芳香族氨基酸及寡肽含量變化的指標(biāo)。 3、選取底物濃度、溫度及pH值作為優(yōu)化因素，以水解度為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化了胰酶酶解牡蠣貝肉的酶解工藝，確定最佳水解條件為：底物濃度16.4％，溫度49℃，初始pH值9.32，酶濃度15000 U/g蛋白，酶解時(shí)間4h，所得酶解產(chǎn)物的水解度為29.8％，蛋白質(zhì)利用率為81.7％。所得水解液中酪氨酸和苯丙氨酸游離率分別達(dá)91.1％和83.3％。 4、從三種不同性質(zhì)的吸附

5、劑中篩選出合適的吸附劑為活性炭TX-325并確定其最佳的吸附條件：固液比1:30，pH值2.50，吸附時(shí)間3h，吸附溫度為25℃，所得酶解液的蛋白質(zhì)回收率為61.6％。經(jīng)氨基酸分析結(jié)果顯示，活性炭對芳香族與支鏈氨基酸均有吸附作用，且其對芳香族氨基酸的吸附(74.1％)遠(yuǎn)高于支鏈氨基酸(30.7％)。此外，活性炭吸附處于結(jié)合態(tài)芳香族氨基酸的能力明顯強(qiáng)于游離態(tài)。由于活性炭未能有效吸附處于游離態(tài)的芳香族氨基酸，使得活性炭吸附后酶解液F值只達(dá)到

6、8.24，尚未達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)F值大于20或以上。 5、經(jīng)活性炭吸附后酶解液進(jìn)一步采用Biogel P2聚丙烯酰胺凝膠層析法去除游離態(tài)的芳香族氨基酸。確定最終分離條件為：3倍濃度吸附液，上樣量2.0mL，使用0.05M的碳酸氫銨洗脫液進(jìn)行洗脫，流速為0.4 mL/min。經(jīng)過凝膠層析法分離純化后，酶解液中的支鏈氨基酸占總氨基酸含量的13.5％，其中芳香族氨基酸均未被檢出，所得F值大于20，分子量在181～1450 Da間，達(dá)到高F