近江牡蠣一種四跨膜素鑒定及功能研究.pdf

1、軟體動物的免疫系統(tǒng)包括體液應(yīng)答和各種免疫細(xì)胞的細(xì)胞反應(yīng)，這些反應(yīng)包括活性氧的產(chǎn)生，抗微生物肽的分泌，包囊作用以及吞噬作用，例如，血淋巴細(xì)胞形成了宿主的主要防御系統(tǒng)，血淋巴細(xì)胞的粘附和運(yùn)動在吞噬外來異物和向炎癥部位轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。由于血淋巴細(xì)胞的粘附行為，造成諸如對寄生蟲的包囊作用和血淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的凝血反應(yīng)等，這些反應(yīng)可能是由于位于細(xì)胞表面的特異的受體分子誘導(dǎo)的，且這些受體接收和傳遞不同的生物反應(yīng)信號。因此，鑒定影響軟體動物免疫

2、系統(tǒng)的因子如血淋巴細(xì)胞的表面受體分子將有助于我們搞清楚作為病原載體的軟體動物的免疫系統(tǒng)，同時為理解寄生蟲的傳播開辟一條新途徑。
　　 本研究利用SMARTTM技術(shù)構(gòu)建了近江牡蠣（Crassostrea ariakensis）LPS刺激下血淋巴細(xì)胞的全長cDNA文庫。經(jīng)篩選和PCR鑒定后我們挑選了120個陽性克隆進(jìn)行了測序分析，共獲得了100個EST序列，其中包含了7個未報道的近江牡蠣血淋巴細(xì)胞的全長序列（四跨膜素tetraspa

3、nin，F(xiàn)J475123;癌基因FosB，F(xiàn)J594438;鐵蛋白ferritin，F(xiàn)J529405;煙酰胺腺嘌呤脫氫酶NADH，F(xiàn)J495091;QM樣蛋白QM-like，F(xiàn)J467930;腺苷高半胱氨酸水解酶SAHH，F(xiàn)J495090;泛素因子u-box，F(xiàn)J495092)。通過NCBI比對和生物信息學(xué)軟件分析，這些基因分別與物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、呼吸代謝、蛋白降解以及天然免疫等作用相關(guān)。
　　 四跨膜素（又稱為四跨膜蛋白）是

4、一種具有四段跨膜結(jié)構(gòu)的大基因家族，該家族成員在哺乳動物、昆蟲、蠕蟲和真菌中都有發(fā)現(xiàn)。四跨膜素蛋白可以調(diào)控細(xì)胞的形狀、運(yùn)動、入侵、融合以及膜表面復(fù)合體的信號傳導(dǎo)。第一種四跨膜素蛋白(ME491/CD63)在1988年進(jìn)行了報道，而標(biāo)志性的序列特征報道則出現(xiàn)在1990年。除了四段跨膜結(jié)構(gòu)以外，四跨膜素還具有幾個保守的氨基酸殘基包括高度保守的CCG，而且還有兩個半胱氨酸殘基，這對于形成四跨膜素的胞外環(huán)結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。在哺乳動物的免疫細(xì)胞（如T和

5、B淋巴細(xì)胞，粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）至少具有八種四跨膜素。這些四跨膜素直接間接通過大量的免疫分子發(fā)生作用，例如T細(xì)胞受體，B細(xì)胞受體，主要組織相容性復(fù)合體1類分子等等。
　　 我們在牡蠣血淋巴細(xì)胞cDNA文庫中鑒定了一種四跨膜素分子命名為 Ca-TSP，并且發(fā)現(xiàn)在血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)中具有變異，發(fā)現(xiàn)三種不同的Ca-TSP分子。利用免疫熒光和免疫電鏡檢測我們發(fā)現(xiàn)Ca-TSP位于牡蠣血淋巴細(xì)胞的顆粒及囊泡

6、狀結(jié)構(gòu)中。序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測以及免疫電鏡檢測顯示Ca-TSP是一種位于顆粒上的整合的糖蛋白，可能是一種和CD63類似的蛋白。通過對分離的牡蠣的血淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)分析，在LPS和PolyI(:)C刺激的前12小時中Ca-TSP的表達(dá)顯示上調(diào)，而H2O2刺激下Ca-TSP的表達(dá)顯示降低。Western blot得出了類似的結(jié)果。實驗同時發(fā)現(xiàn);重組表達(dá)的Ca-TSP可以顯著抑制血淋巴細(xì)胞的聚集，結(jié)果顯示Ca-TSP可能參與牡蠣血淋巴細(xì)胞的天

7、然免疫過程。為了尋求牡蠣四跨膜素的功能性解釋，我們進(jìn)行了蛋白質(zhì)相互作用和信號傳導(dǎo)途徑方面的檢測。免疫熒光實驗結(jié)果顯示Ca-TSP與血藍(lán)蛋白共同位于牡蠣的血淋巴細(xì)胞中，蛋白質(zhì)相互作用檢測發(fā)現(xiàn)Ca-TSP和血藍(lán)蛋白以及一種類凝集素蛋白形成復(fù)合體。未知蛋白檢測出血細(xì)胞凝集特性，但它仍然可能是一種復(fù)合物，因此牡蠣的Ca-TSP的免疫應(yīng)答可能有血藍(lán)蛋白和這種類凝集素的參與。我們利用MEK的抑制劑來檢測可能涉及的信號傳導(dǎo)通路，當(dāng)血細(xì)胞同U0126和