綿羊附紅細(xì)胞體遺傳進(jìn)化、檢測方法、體外培養(yǎng)及感染規(guī)律研究.pdf

1、附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體寄生在多種動(dòng)物紅細(xì)胞表面、血漿、骨髓中引起的一種人畜共患病，綿羊附紅細(xì)胞體病病原是綿羊附紅細(xì)胞體。該病多呈隱性感染，發(fā)病率低，長期以來未引起人們的重視。近年來該病的發(fā)病率呈上升趨勢，藥物治療不徹底，病情反復(fù)難以根除，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外對綿羊附紅細(xì)胞體的研究報(bào)道較少，有關(guān)體外分離培養(yǎng)、分類地位、診斷準(zhǔn)確性等問題都亟待進(jìn)一步研究。本文以自然感染E.ovis綿羊血為試驗(yàn)材料，對綿羊附紅細(xì)胞體16S r

2、RNA基因進(jìn)行了克隆、測序，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，從分子水平上確定其分類地位。并且根據(jù)所獲16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)一對特異性引物，建立了綿羊感染附紅細(xì)胞體PCR診斷方法，并對其季節(jié)流行規(guī)律進(jìn)行了初步研究。在此基礎(chǔ)上對綿羊附紅細(xì)胞體進(jìn)行了體外培養(yǎng)，為進(jìn)一步對綿羊附紅細(xì)胞體代謝過程、生物學(xué)特性和免疫機(jī)理研究提供理論和實(shí)踐依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下： ⑴通過對綿羊附紅細(xì)胞體16S rRNA基因與其他相關(guān)生物基因組比對分析，找到綿羊附紅細(xì)胞體

3、16S rRNA基因相對保守區(qū)，設(shè)計(jì)一對引物，對采集疑似綿羊附紅細(xì)胞體進(jìn)行16Sr RNA基因PCR擴(kuò)增及克隆測序。測序結(jié)果表明：目的片段長1080bp、1079bp（GenBank收錄號(hào)EU916726、FJ440328），同源性分析表明該序列與參考序列（AF338268）同源性達(dá)99.7％；系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，綿羊附紅細(xì)胞體與其他血營養(yǎng)菌在進(jìn)化關(guān)系上組成一個(gè)大的分支，與支原體科，支原體屬病原最為接近，與立克次氏體科的病原較遠(yuǎn)。分析結(jié)果與

4、Neimark等提出的觀點(diǎn)一致，建議將這類血營養(yǎng)菌歸屬支原體科、支原體屬。 ⑵根據(jù)測序得到的綿羊附紅細(xì)胞體16S rRNA基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，建立綿羊附紅細(xì)胞體病PCR診斷方法。特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)表明，該診斷方法與綿羊肺炎支原體、大腸桿菌、葡萄球菌、白色念珠菌、鏈球菌、枯草桿菌等無交叉反應(yīng)，檢測綿羊附紅細(xì)胞體最低DNA量為5.2pg，在-80℃存放1年的血樣中也檢測出了陽性樣品。通過臨床血樣檢測，證明該方法可用于本病的

5、早期感染和隱性感染診斷。 ⑶在RPMI-1640、D-MEM、M-199三種培養(yǎng)基中分別添加不同比例的新生牛血清、綿羊血清進(jìn)行綿羊附紅細(xì)胞體的體外培養(yǎng)效果比較，以確定最佳培養(yǎng)基與血清濃度。培養(yǎng)結(jié)果表明：在RPMI-1640培養(yǎng)液中添加40％新生牛血清，在37℃、5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每12h更換一次培養(yǎng)液，進(jìn)行原代體外培養(yǎng)，得到了優(yōu)于其他試驗(yàn)組的培養(yǎng)效果，所以首選RPMI-1640作為培養(yǎng)液。 ⑷采用鮮血壓片和血液涂