家畜附紅細(xì)胞體體外無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)研究.pdf

1、附紅細(xì)胞體（Haemomycoplasmas，HMs）是一類(lèi)無(wú)細(xì)胞壁、寄生在多種脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞表面的微生物。附紅細(xì)胞體引起的疾病即附紅細(xì)胞體?。‥perythrozoonosis）簡(jiǎn)稱(chēng)附紅體病，豬的附紅體病臨床上較為多見(jiàn)，對(duì)不同年齡段的豬均有危害，現(xiàn)已遍及世界各地，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 由于缺乏體外培養(yǎng)系統(tǒng)，HMs研究進(jìn)展緩慢。早年根據(jù)其部分生物學(xué)特性被分類(lèi)為立克次體（Rickettsiales）。近年來(lái)研究

2、發(fā)現(xiàn)HMs在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上與霉形體（Mycoplasma）的關(guān)系最為接近（76％～83％），且基因組大小（730～770 kb）、堿基組成特點(diǎn)（低G+C％）亦與霉形體類(lèi)似，因而我們推測(cè)附紅細(xì)胞體的營(yíng)養(yǎng)需要、代謝特點(diǎn)可能與霉形體有相似之處，為了更詳細(xì)觀察和研究各種動(dòng)物HMs的菌體形態(tài)、生理生化以及生長(zhǎng)繁殖等特性，破解HAMs在體外無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基中不能人工培養(yǎng)的難題，為HMs的臨床血清學(xué)診斷、藥物篩選及疫苗研制等提供理論基礎(chǔ)，我們將豬等各種動(dòng)物

3、附紅細(xì)胞體接種到通過(guò)配方篩選的霉形體培養(yǎng)基內(nèi)，傳代時(shí)不添加任何陰性紅細(xì)胞，而以更換半量培養(yǎng)基的方式進(jìn)行了體外培養(yǎng)。結(jié)果表明，動(dòng)物附紅細(xì)胞體在體外可長(zhǎng)期傳代并持續(xù)存活；皺縮的附紅細(xì)胞體經(jīng)培養(yǎng)可以恢復(fù)長(zhǎng)大；將豬、羊附紅細(xì)胞體從紅細(xì)胞表面洗脫后亦能按上述方法用霉形體培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代并保持存活；但未能獲得附紅細(xì)胞體大量增殖的結(jié)果。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了病原體低溫保存方法研究、抗生素敏感性試驗(yàn)，主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1．豬、兔、犬、牛、羊

4、附紅細(xì)胞體的體外連續(xù)培養(yǎng)
　　 臨床發(fā)生附紅細(xì)胞體病豬血樣，經(jīng)PCR擴(kuò)增和Giemsa染色鏡檢證明感染豬附紅細(xì)胞體（Mycoplasm suis，M． suis）。經(jīng)PCR擴(kuò)增所得DNA片段，與M． suis已知序列同源性達(dá)99％以上。兔、犬、牛、羊血樣若干份，經(jīng)Giemsa染色鏡檢為HM陽(yáng)性，紅細(xì)胞染蟲(chóng)率（PPE）在50％～95％之間。
　　 經(jīng)預(yù)試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件優(yōu)化后，將豬、兔、犬、牛、羊等動(dòng)物的HM陽(yáng)性紅細(xì)胞接種到多

5、種培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)，不添加陰性紅細(xì)胞，每次傳代更換半量培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)配方篩選的霉形體培養(yǎng)基PPLO-S-BS（PPLO Broth添加牛血清等成份）培養(yǎng)豬、兔、犬HM效果最佳，連續(xù)維持蟲(chóng)體（附紅細(xì)胞體簡(jiǎn)稱(chēng)，下同）存活分別達(dá)280d、300 d、270 d以上，紅細(xì)胞染蟲(chóng)率、染蟲(chóng)強(qiáng)度保持不變，蟲(chóng)體飽滿(mǎn)光亮、活力較強(qiáng)；牛HM接種培養(yǎng)基后蟲(chóng)體皺縮，但經(jīng)PPLO-S-BS等6種培養(yǎng)基培養(yǎng)蟲(chóng)體長(zhǎng)大，并能維持其存活達(dá)120-150 d以上；PPLD

6、-S-BS等8種培養(yǎng)基可維持羊HM存活達(dá)90～120d以上。
　　 將M． suis、羊HM從紅細(xì)胞洗脫后同法用PPLD-S-BS分別培養(yǎng)，培養(yǎng)至90 d、100 d左右后每5～10 d按1：2（v/v）的比例傳代，累計(jì)傳代各50次、45次，連續(xù)培養(yǎng)380 d后終止。
　　 通過(guò)對(duì)M． suis培養(yǎng)物PCR鑒定，對(duì)M． suis、兔HM、犬HM培養(yǎng)物的感染陰性紅細(xì)胞試驗(yàn)，對(duì)M．suis、犬HM培養(yǎng)物掃描電鏡觀察，對(duì)所有培

7、養(yǎng)物的光鏡觀察、抗生素敏感性試驗(yàn)，證實(shí)經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)的蟲(chóng)體與接種物為相同病原，所有傳代附紅細(xì)胞體一直處于存活并緩慢增殖狀態(tài)。
　　 2．豬、兔、犬、牛、羊附紅細(xì)胞體的低溫保存研究
　　 將豬、兔、犬、牛、羊感染HM全血以檸檬酸三鈉抗凝等方法處理后，于4℃保存，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬酸三鈉抗凝后直接保存效果最佳，至少3 weeks后紅細(xì)胞基本保持完整，染蟲(chóng)率不變，蟲(chóng)體存活狀態(tài)良好，保存后皺縮的蟲(chóng)體經(jīng)培養(yǎng)可以恢復(fù)長(zhǎng)大。
　　 用改

8、良低濃度甘油冷凍法等3種方法長(zhǎng)期低溫凍存豬、兔、犬、牛、羊感染HM的紅細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改良低濃度甘油冷凍法凍存上述染蟲(chóng)紅細(xì)胞效果最佳，復(fù)蘇后紅細(xì)胞存活率最高，PPE不變，HM保持有較好的活性。
　　 3．豬、兔、犬附紅細(xì)胞體藥物敏感試驗(yàn)
　　 有效藥物作用于染蟲(chóng)紅細(xì)胞后，蟲(chóng)體首先從紅細(xì)胞上游離至培養(yǎng)液中，具有明顯的自主運(yùn)動(dòng)，后運(yùn)動(dòng)減弱，蟲(chóng)體消失不見(jiàn)。紅細(xì)胞染蟲(chóng)率、染蟲(chóng)強(qiáng)度不同程度下降，形態(tài)恢復(fù)正常，運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)消失。