黃曲霉毒素B-,1-和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對錦鯉及原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的毒性研究.pdf

1、真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，廣泛污染各種飼料及飼料原料.動物攝入被真菌毒素污染的飼料會造成動物的真菌毒素中毒。黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一大類結(jié)構(gòu)相似的次級代謝產(chǎn)物，是目前已知的最穩(wěn)定，毒性最強(qiáng)的毒素.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是禾谷鐮刀菌在生長過程中產(chǎn)生的一種主要代謝產(chǎn)物，是單端孢霉烯族毒素的一種，毒性和黃曲霉毒素相比較弱，但廣泛存在于各種谷物和飼料. 本論文主要研究這兩種毒素在常規(guī)劑量下對錦鯉的毒性作用，

2、分別從體內(nèi)試驗和體外試驗兩個方面對兩種毒素單獨和聯(lián)合作用對錦鯉的毒性作用進(jìn)行了研究. 試驗I：江蘇省水產(chǎn)飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的污染情況調(diào)查 分別從江蘇省各地(揚(yáng)州、鹽城、蘇州和徐州等)收集的水產(chǎn)飼料及飼料原料，其中粉狀料15份，顆粒料15份.毒素經(jīng)提取凈化后，HPLC檢測含量. 測定結(jié)果表明，在粉狀料和顆粒料中，AFB1的陽性檢出率分別為40％和26.7‰DON的陽性檢出率均為100

3、％，從真菌毒素的絕對含量來看，AFB1的最高含量為16.4μg kg-1，低于國家規(guī)定的飼料及飼料原料最大允許量(20μg kg-1)；而DON的最高含量為7046μg kg-1，高于國家配合飼料允許含量標(biāo)準(zhǔn)(1000μg kg-1). 試驗II：黃曲霉毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對錦鯉生長性能、血液生化和組織病理學(xué)的影響 錦鯉270尾(均重為18±0.1g)，分為9組，每組10尾，每組設(shè)三個平行，2個平行組進(jìn)行試驗觀察

4、和統(tǒng)計，1個平行組作為試驗過程中解剖檢查用(在第1、20、40天各取樣3尾剖檢).分別飼喂基礎(chǔ)日糧、基礎(chǔ)日糧+AFB1(0.05mg kg-1)、基礎(chǔ)日糧+AFB1(0.1mg kg-1)、基礎(chǔ)日糧+DON(1mg kg-1)、基咄日糧+DON(5mg kg-1)、基咄日糧+AFB1(0.05mg kg-1)+DON(1 mg kg-1)、基礎(chǔ)日糧+AFB1(0.05mg kg-1)+DON(5 mg kg-1)、基礎(chǔ)日糧+AFB1(0

5、.1 mg kg-1)+DON(1 mg kg-1)、基礎(chǔ)日糧+AFB1(0.1mg kg-1)+DON(5mg kg-1)。試驗為期40天。每20天進(jìn)行體重、體長、豐滿系數(shù)、肝胰臟重/體重比、血清生化指標(biāo)檢測(ALP、ALB、ALT、AST、TP)以及肝胰臟、脾臟和腸道的組織學(xué)檢查。試驗結(jié)果表明：不管是毒素單獨作用還是聯(lián)合作用，均能不同程度的引起錦鯉生長性能的降低，并表現(xiàn)出體重、豐滿系數(shù)的下降，血清生化指標(biāo)的變化和組織的病理學(xué)損傷。隨

6、著毒素濃度的升高，毒素的毒性作用顯著增加，具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。和毒素單獨作用相比，兩種毒素聯(lián)合作用后毒性明顯大于一種毒素單獨作用，具有一定的協(xié)同作用。 試驗III：錦鯉原代肝細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)條件的優(yōu)化 在本試驗中，選用三種不同的細(xì)胞分離方法(機(jī)械分離法、膠原酶灌注法和胰酶-EDTA消化法)來獲得肝細(xì)胞，并將其置于三種不同的培養(yǎng)基中(DMEM，M199和L-15)，在不同的培養(yǎng)條件下(17℃、27℃和37℃，5％

7、CO2供應(yīng)和無CO2供應(yīng))進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)時間為7天，篩選出最方便、實用的錦鯉肝細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)方法。結(jié)果表明：采用胰酶-EDTA消化法來分離細(xì)胞，并將得到的肚細(xì)胞用L-15培養(yǎng)基(無CO2供應(yīng))或M199培養(yǎng)基(有5％CO2供應(yīng))于27℃培養(yǎng)可獲得狀態(tài)良好的肝細(xì)胞，滿足進(jìn)行毒理學(xué)試驗的要求。 試驗IV：黃曲霉毒素B1和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對錦鯉原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的毒性作用的研究 在試驗III的基礎(chǔ)上，對分離得到的肝細(xì)胞進(jìn)

8、行培養(yǎng)，分別設(shè)置AFB1組(0.01μgmL-1和0.02μg mL-1)，DON組(125ng mL-1、250 ng mL-1、500 ng mL-1、1000 ng mL-1和2000 ng mL-1)，聯(lián)合毒性組(0.01+125、0.01+250、0.01+500、0.02+125，0.02+250和0.02+500，單位分別為μg mL-1和ng mL-1)，試劑對照組(DMSO:2μL mL-1)及空白對照組，每隔2h，從

9、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、酶活性和細(xì)胞毒性三個方面研究這兩種真菌毒素對錦鯉原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的單獨和聯(lián)合毒性作用，試驗時間為24h。試驗結(jié)果表明：光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)兩種毒素均能在短時間內(nèi)引起細(xì)胞的大量死亡，各試驗組均與對照組之間差異顯著.在電鏡下，和對照組相比，低濃度聯(lián)合毒性組和DON組均能發(fā)現(xiàn)數(shù)量不等的凋亡細(xì)胞，而低濃度的AFB1組則僅見個別凋亡的肚細(xì)胞。 試驗V：黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和兩種毒素聯(lián)合作用對錦鯉原代肝細(xì)胞DNA損傷的研

10、究 在本試驗中，分別采用單細(xì)胞凝膠電泳和DNA ladder兩種方法對毒素引起的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行了研究。用單細(xì)胞凝膠電泳進(jìn)行研究的結(jié)果是，肝細(xì)胞凋亡率最高的為聯(lián)合毒素組[AFB1+DON:0.02(μg mL-1)+125(ng mL-1)]組，其次為DON500ng mL-1組，再次為AFB1+DON:0.01(μg mL-1)+125(ng mL-1)組.用DNA ladder進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，DON(≤500ng mL-1)