黃曲霉毒素B-,1-單抗的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、黃曲霉毒素B<,1>常會(huì)污染植物和動(dòng)物源性食品，被動(dòng)物攝入體內(nèi)后，還可轉(zhuǎn)化成毒性也較大的黃曲霉毒素M<,1>等衍生物。黃曲霉毒素B<,1>具有致癌、致畸、致突變作用，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成巨大的威脅。加強(qiáng)對(duì)黃曲霉毒素B<,1>的檢測(cè)，對(duì)確保食品安全具有重要意義。 黃曲霉毒素B<,1>的檢測(cè)方法主要有薄層層析法、高效液相色譜法及免疫學(xué)方法等。薄層層析法靈敏度不高，特異性不強(qiáng)，易被其它熒光物質(zhì)干擾，且分析時(shí)間較長(zhǎng)；高效液相色譜法雖然靈敏度高

2、，但檢測(cè)儀器化程度高、設(shè)備昂貴，操作技術(shù)要求高，前處理凈化要求高；免疫學(xué)方法由于其特異性強(qiáng)、靈敏度高，前處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，比較容易推廣使用。酶聯(lián)免疫吸附法可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快，是一個(gè)準(zhǔn)確性、安全性高，實(shí)用性強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)。 玉米是我國(guó)較為常用的動(dòng)物飼料來(lái)源，因玉米發(fā)霉導(dǎo)致動(dòng)物黃曲霉毒素急、慢性中毒的病例屢見(jiàn)不鮮。本研究運(yùn)用化學(xué)合成方法制各AFB<,1>完全抗原，采用單克隆抗體技術(shù)制備靈敏度高、特異性強(qiáng)、

3、效價(jià)高的抗體，建立了ELISA測(cè)定方法。采集玉米樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，優(yōu)化玉米樣品中AFBI的提取凈化方法，最終建立穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)玉米中AFB<,1>的方法。 用AFB<,1>與羧甲基羥胺半鹽酸鹽在吡啶中反應(yīng)生成AFB<,1>O，再用活性酯法將AFB<,1>O與蛋白質(zhì)偶聯(lián)合成完全抗原。用TLC法對(duì)AFB<,1>O的轉(zhuǎn)化進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，用紫外掃描法鑒定每步反應(yīng)的合成效果，并根據(jù)掃描結(jié)果計(jì)算載體蛋白與毒素的結(jié)合比。經(jīng)改進(jìn)的方法

4、合成過(guò)程更為簡(jiǎn)單，同時(shí)AFB<,1>的肟化率和AFB<,1>O的利用率較高，分別達(dá)到84.3％和55.4％。 用AFB<,1>-HA免疫Balb/C小鼠，四免后陽(yáng)性血清效價(jià)在1：100,000以上。經(jīng)單克隆抗體技術(shù)篩選，獲得8株可持續(xù)分泌針對(duì)AFB<,1>抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為 1-5G4、2-6A8、2-A5、2-B1、2-B3、2-B5、2-B6和2-D3。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng)30代和在液氮中凍存180

5、d復(fù)蘇后，培養(yǎng)上清中抗體的效價(jià)基本保持不變。 用 1-5G4、2-6A8、2-A5、2-B6和2-D3五株細(xì)胞制備得5種腹水，效價(jià)全部在1：1，000,000以上。用1-5G4和2-6A8兩株單抗建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELASA的檢測(cè)方法。包被抗原AFB<,1>-BSA和腹水抗體的工作濃度分別為1:8,000和1:100,000，用2％OVA，37℃下封閉2h。 使用1-5G4腹水檢測(cè)時(shí)，AFB<,1>濃度在0.1～5ng/ml

6、時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，線性方程為y=-07506x+0.6456(r=-0.9960)，IC<,50>為1.09ng/ml，LOD低于0.1ng/ml，LOQ為0.2ng/ml。使用2-6A8腹水檢測(cè)時(shí)，AFB<,1>濃度在0.5～50ng/ml時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，線性方程為y=0.3998x+0.739(r=-0.9937)，IC<,50>為5.83ng/ml，LOD低于0.5ng/ml，LOQ為0.55ng/ml。對(duì)玉米樣品中的A