抗黃曲霉毒素B-,1-單克隆抗體的制備與特性鑒定.pdf

1、黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A．parasiticus)等產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的次生代謝產(chǎn)物。其中黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最大、致癌性最強的一種真菌毒素。調(diào)查表明，世界范圍內(nèi)AFT污染十分普遍。因此，AFT受到最廣泛的重視，各國政府都制定了十分嚴格的食品中AFT的限量標準。自20世紀六十年代以來，已逐漸探索出了多種AFT。

2、的檢測方法。這些方法都曾在各個歷史時期為檢測AFT作出了一定貢獻，但也存在著操作復(fù)雜、污染大、對儀器設(shè)備要求高、假陽性率高、檢測時間長等缺陷。隨著時代發(fā)展，大部分方法已經(jīng)不能適應(yīng)當代社會要求的污染小、靈敏度高、檢測時間短及操作簡單的檢測要求。以免疫分析為基礎(chǔ)的準確、快速、無污染、智能化檢測技術(shù)已成為AFBI快速檢測方法研究的熱點。其中免疫親和層析技術(shù)由于其對AFT的提取效率高、凈化程度高，越來越受研究人員的推崇，該方法是目前公認的最有效

3、的AFB1凈化方法。而高親和力、高靈敏度、質(zhì)量穩(wěn)定的抗體是建立理想檢測方法的前提，是應(yīng)首先解決的問題。 本研究的主要內(nèi)容包括：抗AFB1單克隆抗體的制備和特性鑒定及其免疫親和柱的初步研制。 目的：通過雜交瘤細胞技術(shù)制備抗AFB1單克隆抗體，并對所制備的單克隆抗體進行特性鑒定和初步應(yīng)用。 方法：(1)以AFB1-BSA作為抗原免疫BALB/c小鼠；(2)取免疫效果最佳的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/O進行融合；(3

4、)以AFB1-OVA作為檢測抗原，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測雜交瘤細胞的上清進行篩選，保留陽性孔，用有限稀釋法進行三次克隆化，得到能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；(4)探索大量制備和純化所得抗體的方法和條件；(5)鑒定對所得單克隆抗體的特性(6)初步應(yīng)用該單克隆抗體，研制AFB1免疫親和柱。 結(jié)果：(1)得到一株能穩(wěn)定分泌抗AFB1單克隆抗體的雜

5、交瘤細胞株5E10。 此單克隆抗體的亞類為IgG2b，親和常數(shù)是4.79x108M-1，與AFB2、AFG1、AFG2、AFM1的交叉反應(yīng)率分別為＜26.06％、63.68％、26.06％、38.26％。(2)單克隆抗體的大量制備采用動物體內(nèi)生產(chǎn)的方法，即以不完全弗氏佐劑(freund'sincomplete adjuvant，F(xiàn)IA)為致敏劑預(yù)處理12周齡以上的BALB/c小鼠。一周內(nèi)腹腔注射雜交瘤細胞1～5×106個/只，1

6、0天后便可采集腹水；辛酸硫酸銨法(CA-AS)適用于該單抗的大量純化。(3)初步制備AFB1單抗免疫親和柱，采用熒光分光光度法確定AFB1單抗免疫親和柱的使用條件。使用條件為：5mL0.01M PBS(pH7.4)平衡；上樣緩沖液中甲醇濃度為10％；上樣后2mL超純水洗滌；1mL80％甲醇-水洗脫，20mL0.01M PBS(pH7.4)再生。制備的AFB1單抗免疫親和柱其抗體濃度與柱容量的關(guān)系為y=85.63x-0.043，其中R2=