防治脫氧雪腐鐮刀烯醇毒素污染的脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)的研究.pdf

1、禾谷鐮刀菌是自然環(huán)境中小麥赤霉病的主要致病菌，在生長(zhǎng)和侵染作物過(guò)程中產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀烯醇毒素（DON），聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將DO N定為“最危險(xiǎn)的自然發(fā)生食品污染物”。我國(guó)多次對(duì)小麥、玉米及相關(guān)制品的真菌毒素污染調(diào)查結(jié)果顯示，樣品 DO N毒素污染率較高。目前主要使用化學(xué)殺真菌劑如多菌靈等防治禾谷鐮刀菌的污染。大部分農(nóng)藥殘存在自然環(huán)境中，嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境安全、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全、人和動(dòng)物的生命安全。生物學(xué)防治是目前比較有應(yīng)用前景的

2、控制病原真菌及其毒素污染的措施，同時(shí)能夠減少化學(xué)農(nóng)藥使用量、降低農(nóng)業(yè)面源污染。生物農(nóng)藥高效、安全、環(huán)境相容性好，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。但是，關(guān)于微生物防治儲(chǔ)藏小麥 DO N毒素污染的報(bào)道較少。因此本課題對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的分離自花生果殼、種子及莢果際等處的細(xì)菌進(jìn)行篩選，以期獲得在儲(chǔ)藏環(huán)境條件下能夠抑制麥粒中禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)和毒素產(chǎn)生的細(xì)菌及其活性物質(zhì)，為開(kāi)發(fā)用于儲(chǔ)糧的新型生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。
　　本研究首先利用平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，初篩到44株對(duì)禾谷

3、鐮刀菌菌絲體生長(zhǎng)抑制率在40％以上的菌株。Tip culture實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)菌發(fā)酵上清液的鐮刀菌抑制活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果38株菌顯示90%以上的抑制率。禾谷鐮刀菌侵染麥粒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)菌發(fā)酵上清液對(duì)DO N毒素產(chǎn)生的影響，在鐮刀菌侵染麥粒18天后，HP LC檢測(cè)毒素的相對(duì)含量，結(jié)果14株菌的抑毒率在50%以上，其中菌株WPS4-1和WPP9的活性最高，抑制率90%左右。對(duì)14株細(xì)菌進(jìn)行了形態(tài)、生理生化鑒定及16S RN A基因和gy rA基因

4、分子鑒定，表明所有菌株均為芽孢桿菌屬，與解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens的親緣關(guān)系最近。
　　用不同的溫度（35℃、60℃和121℃）、不同pH（pH1.0、3.0、5.0、9.0、11.0和13.0）和3種蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K）對(duì)拮抗細(xì)菌的發(fā)酵上清液進(jìn)行處理，結(jié)果表明拮抗物質(zhì)對(duì)溫度和酸性條件具有較好的穩(wěn)定性，對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。為了初步判斷拮抗物質(zhì)的類(lèi)別，選擇了芽孢桿菌屬

5、真菌拮抗物質(zhì)的基因相對(duì)應(yīng)的19對(duì)引物，對(duì)拮抗菌的基因組DN A進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果14對(duì)引物獲得了陽(yáng)性擴(kuò)增，基因序列經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，與目的基因相似性在97~99%。因此判斷基因組中含有與通過(guò)核糖體途徑合成的羊毛硫類(lèi)抗菌物質(zhì)ericin和sublancin、以及通過(guò)非核糖體途徑合成的脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)伊枯草菌素家族 iturins、表面活性素surfactin、芬薺素 fengycin和桿菌溶素bacilysin等合成相關(guān)的基因。
　　分別使用

6、硫酸銨沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、有機(jī)溶劑萃取和鹽酸沉淀等方法分離細(xì)菌發(fā)酵上清液中的禾谷鐮刀菌拮抗物質(zhì)。60%飽和度硫酸銨沉淀物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制率為78.07±3.21%，乙醇沉淀物和丙酮沉淀物的抑制率僅為4.92±1.81%和9.61±1.04%，四種有機(jī)溶劑乙酸乙酯、正丁醇、苯和氯仿萃取物的抑制率分別為87.01±2.41%78.11±5.97%、73.16±3.29%和46.17±4.42%，鹽酸沉淀的甲醇提取物的抑制率為100%。因此

7、根據(jù)粗提物的禾谷鐮刀菌抑制活性，判斷鹽酸沉淀的方法分離效果最好。吸附實(shí)驗(yàn)表明，大孔樹(shù)脂 D296R和D301 R具有較高的色素吸附而較低的活性物質(zhì)吸附能力，適合細(xì)菌發(fā)酵上清液中色素雜質(zhì)的去除。去色素的上清液經(jīng)濃鹽酸沉淀（pH3.0）、甲醇抽提，獲得脂肽粗提物。去色素上清液與脂肽粗提物的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果表明，WPS4-1可以產(chǎn)生伊枯草菌素和表面活性素類(lèi)抗菌物質(zhì)。
　　對(duì)脂肽粗提物的抗禾谷鐮刀菌活性及機(jī)理進(jìn)行了探討

8、。Tip culture實(shí)驗(yàn)獲得脂肽粗提物對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲體生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度IC50為8.51μg/mL，禾谷鐮刀菌侵染麥粒實(shí)驗(yàn)表明，脂肽粗提物可以延遲或抑制其孢子的萌發(fā)，減少毒素的產(chǎn)量。光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察表明抑制作用體現(xiàn)在抑制孢子萌發(fā)和使菌絲畸形破裂，而且隨脂肽濃度增加，抑制作用增強(qiáng)。脂肽粗提物處理的鐮刀菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率增加，提示菌絲細(xì)胞膜受到破壞。熒光定量PC R分析表明含120μg/mL脂肽粗提物的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的菌絲體，其

9、Tri5基因的表達(dá)量明顯低于對(duì)照，說(shuō)明脂肽粗提物通過(guò)抑制 DO N合成基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)鐮刀菌產(chǎn)毒的抑制作用。
　　芽孢桿菌脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)的生物合成受發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的影響。采用單因素實(shí)驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定拮抗菌株發(fā)酵產(chǎn)脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)基組成為小米面13.7 g/L、黃豆餅粉2.5 g/L和硝酸鈉3.0 g/L。用此培養(yǎng)基發(fā)酵獲得的上清液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制率為90.38±1.33%，明顯高于原培養(yǎng)基的抑制率79.25