煙草控制表皮毛發(fā)育的因子NtTTG1和控制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的因子NtARP1對(duì)過敏反應(yīng)與抗病性的調(diào)控作用.pdf

1、過敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)和系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance，SAR)是植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)中的兩個(gè)標(biāo)志性事件。以往研究表明，多種不同來源的激發(fā)子都可以誘導(dǎo)植物的抗病防衛(wèi)反應(yīng)的啟動(dòng)，同時(shí)，研究也發(fā)現(xiàn)調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的信號(hào)通路與抗病防衛(wèi)信號(hào)通路存在交叉對(duì)話，一些調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控因子同時(shí)也參與調(diào)控抗病防衛(wèi)的調(diào)控。
　　 蛋白類激發(fā)子elicitins是由卵菌分泌的

2、一類小分子蛋白質(zhì).這種小蛋白可以在煙草上引起類似過敏反應(yīng)的壞死和系統(tǒng)獲得抗性的產(chǎn)生。其中，ParA1是由寄生疫霉Phytophthra parasitica var nicotianae分泌產(chǎn)生的一種elicitin。對(duì)于ParAl激發(fā)子的研究表明，用ParA1蛋白注射煙草葉片，可以引起強(qiáng)烈的HR反應(yīng)；而且，噴施葉片后，也可引起micro-HR(microscopic hypersenseitve response，micro-HR)的

3、發(fā)生和一系列防衛(wèi)反應(yīng)的快速啟動(dòng).利用ParAl處理煙草葉片的表皮毛，可以引起表皮毛細(xì)胞發(fā)生一系列的micro-HR相關(guān)反應(yīng)。這表明，表皮毛內(nèi)存在著一套接受外源激發(fā)子ParA1信號(hào)的分子機(jī)制。但是，ParAl是如何被植物體識(shí)別的？表皮毛是如何參與到ParAl引發(fā)的micro-HR過程之中的？另外，本實(shí)驗(yàn)室通過體細(xì)胞無性系變異方法產(chǎn)生的煙草矮化突變體表現(xiàn)組成性的系統(tǒng)獲得性抗性，那么，此突變體內(nèi)是否存在著同時(shí)控制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和防衛(wèi)的調(diào)控因子？本研

4、究著重剖析控制生長(zhǎng)發(fā)育的因子對(duì)過敏反應(yīng)及抗病性的調(diào)控作用。
　　 1.煙草葉片表皮毛在ParA1引發(fā)HCD過程中的作用
　　 將蛋白激發(fā)子ParAl注射煙草葉片，可以引發(fā)植物過敏性細(xì)胞死亡(hypersensitve cell death, HCD)。ParA1噴施煙草葉片時(shí)，可以引發(fā)植物產(chǎn)生肉眼不可見的微敏反應(yīng)，并伴隨有活性氧迸發(fā)(ROS burst)和Chromatin condensation(Cc)的發(fā)生。表皮毛

5、作為煙草最外部的天然屏障，勢(shì)必最早接觸ParAl激發(fā)子并參與其誘導(dǎo)的micro-HR過程，以micro-HR發(fā)生過程中的重要信號(hào)分子H2O2和細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)凝集為切入點(diǎn)，研究了表皮毛對(duì)于ParAl激發(fā)子誘導(dǎo)的響應(yīng)。DCFH-DA染色及熒光觀察結(jié)果表明，ParAl處理后th表皮毛內(nèi)就發(fā)生活性氧迸發(fā)，這比葉肉細(xì)胞早2h，其產(chǎn)生的活性氧并可以向葉肉細(xì)胞傳導(dǎo).DAPI熒光分析表明，表皮毛內(nèi)染色質(zhì)凝集的發(fā)生要比葉肉細(xì)胞早5h左右。Trypan b

6、lue染色，并配合質(zhì)壁分離實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明了細(xì)胞死亡在ParA1處理后1h到12h中，從表皮毛向底部細(xì)胞逐漸擴(kuò)散，表皮毛細(xì)胞死亡發(fā)生比葉肉細(xì)胞早大約5h，且表皮毛在每個(gè)時(shí)間段內(nèi)的細(xì)胞死亡數(shù)都高于葉肉細(xì)胞。RT-PCR方法檢測(cè)了HR反應(yīng)中的標(biāo)志基因PAL、hinl和hsr203的表達(dá)，三個(gè)基因在ParA1處理后12h的表皮毛中都有明顯表達(dá)，而在葉內(nèi)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)稍晚一些。這些結(jié)果表明，HR信號(hào)有從表皮毛向葉肉細(xì)胞中傳導(dǎo)的趨勢(shì)。
　　 2

7、.ParA1功能缺失性突變蛋白的獲得及功能驗(yàn)證
　　 根據(jù)以往研究，ParA1中含有6個(gè)保守的半胱氨酸，且兩兩結(jié)合形成三對(duì)二硫鍵維持著ParA1特異的空間構(gòu)象。此種結(jié)構(gòu)對(duì)于ParA1的功能行使是必要的.本研究主要通過點(diǎn)突變的方法將ParA1中的51位半胱氨酸替換為絲氨酸，得到了基因C51S，蛋白表達(dá)得到了突變蛋白C51S。通過誘導(dǎo)HR的功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，C51S完全喪失了在煙草葉片上誘導(dǎo)HR的能力。配合DAB和trypan b1ue

8、染色而分別進(jìn)行了活性氧和micro-HR的檢測(cè)，C51S不能誘導(dǎo)活性氧迸發(fā)和micro- HR的產(chǎn)生。C51S處理表皮毛后12h，仍檢測(cè)不到活性氧迸發(fā)和染色質(zhì)凝集現(xiàn)象的發(fā)生。這些結(jié)果表明，C51S已經(jīng)完全喪失了ParA1的生物功能。
　　 3.NtTTG1基因的克隆以及NtTTG1與ParA1之間的互作
　　 通過多種方式鑒定NtTTG1是與ParA1發(fā)生互作的一個(gè)蛋白.根據(jù)擬南芥中參與葉片表皮毛發(fā)育的幾個(gè)關(guān)鍵基因序列分

9、別設(shè)計(jì)引物，在煙草中篩選可以受ParA1誘導(dǎo)表達(dá)的同源物。發(fā)現(xiàn)只有AtTTG1的同源物的表達(dá)受誘導(dǎo)表達(dá)，并依此克隆到NtTTGI基因。NtTTG1在表皮毛中被ParA1的誘導(dǎo)表達(dá)程度明顯強(qiáng)于葉肉細(xì)胞。在酵母雙雜交中，NtTTG1與ParA1發(fā)生互作，而不與C51S發(fā)生互作。同樣，NtTTG1的突變蛋白S94F也不能與ParA1發(fā)生互作。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，51位的半胱氨酸位于ParA1蛋白的邊緣，這個(gè)位置很可能在與其他蛋白的互作中起作用；

10、由苯丙氨酸替換了NtTTG1中靠近WD40結(jié)構(gòu)域的絲氨酸而得到的S94F中，絲氨酸的位置也在分子互作中起重要作用。Pull-down assay結(jié)果也證明ParA1與NtTTG1之間的物理互作.NtTTG1與ParA1之間的互作經(jīng)兩個(gè)蛋白在植物表皮毛中的亞細(xì)胞定位而進(jìn)一步驗(yàn)證。融合有熒光蛋白R(shí)FP的NtTTG1在植物中的瞬時(shí)表達(dá)，這個(gè)融合基因在瞬時(shí)表達(dá)12h后在表皮毛中有大量的轉(zhuǎn)錄.熒光觀察表明，在ParA1誘導(dǎo)下，NtTTG1-RFP

11、明顯的定位于表皮毛細(xì)胞的細(xì)胞膜上。熒光疊加結(jié)果表明，NtTTG1-RFP與ParA1-eGFP相結(jié)合，而與C51S-eGFP不結(jié)合，而且，這種互作發(fā)生在細(xì)胞膜附近。
　　 4.NtTTG1基因的沉默及其沉默效應(yīng)檢測(cè)
　　 為了進(jìn)一步確認(rèn)NtTTG1在激活HR信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，通過病毒誘導(dǎo)的RNA干擾機(jī)制，對(duì)NtTTG1進(jìn)行沉默操作。NtTTG1基因沉默后，ParA1不能誘導(dǎo)NtTTG1在表皮毛和葉肉細(xì)胞中的表達(dá)，hin1

12、基因也不能被誘導(dǎo)表達(dá)；表明NtTTG1是HR信號(hào)通路中的一個(gè)重要組份。與對(duì)照植株相比，RNA干擾處理植株的表皮毛和葉肉細(xì)胞發(fā)生染色質(zhì)凝集和活性氧迸發(fā)的時(shí)間分別有3h和大約Sh的延遲，而且，在每個(gè)時(shí)間段上，這些反應(yīng)的發(fā)生程度明顯減弱。因此，表皮毛在激活HR途徑中先于葉肉細(xì)胞，NtTTG1起著至關(guān)重要的作用，進(jìn)一步證實(shí)了葉片表皮毛在感受外源信號(hào)中的重要性。
　　 5.-種生長(zhǎng)素抑制蛋白調(diào)控?zé)煵莅蛔凅w的組成性系統(tǒng)獲得抗性本實(shí)驗(yàn)室對(duì)

13、野生型煙草(Nc89)進(jìn)行體細(xì)胞無性系變異處理，得到組成性表達(dá)SAR的突變體ces1-1。與野生型相比，ces1-1表型矮化但卻對(duì)真菌的侵染表現(xiàn)抗性.這種突變體能組成性的表達(dá)植物抗病反應(yīng)基因，但是卻不能表達(dá)植物生長(zhǎng)途徑中的伸展素expansin基因?；亟坏倪z傳分析表明，ces1-1是在野生型位點(diǎn)上的單基因顯性突變.差異顯示表明，在ces1-1中得到了一個(gè)與編碼生長(zhǎng)素抑制蛋白的基因NtARP1一致的轉(zhuǎn)錄本.通過RACE的方法克隆到NtAR

14、P1基因，并檢測(cè)了生長(zhǎng)素對(duì)基因表達(dá)的影響。基于上述研究結(jié)果，本研究對(duì)NtARP1基因進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NtARP1定位在ces1-j的細(xì)胞核上。經(jīng)過IAA處理的ces1-1，其NtARP1的表達(dá)和NtARP1蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生均受到抑制。我們進(jìn)而對(duì)NtARP1在調(diào)控?zé)煵莸纳L(zhǎng)防衛(wèi)功能上進(jìn)行了研究。當(dāng)突變體ces1-1中的NtARPI被沉默時(shí)，其生長(zhǎng)恢復(fù)了野生型的表型，但是喪失了組成性表達(dá)SAR的特性。ces1-1中的IAA含量低于野生型，然

15、而，外部施用IAA可以使ces1-1中IAA含量恢復(fù)到野生型水平.我們的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，在突變體ces1-1中，煙草NtARP1基因編碼的生長(zhǎng)素抑制蛋白負(fù)向調(diào)控生長(zhǎng)而正向調(diào)控防衛(wèi)。
　　 本研究主要有兩方面創(chuàng)新。第一，試驗(yàn)證明煙草葉片表皮毛在ParA1引發(fā)的過敏反應(yīng)中起著重要的信號(hào)識(shí)別和傳導(dǎo)作用。在煙草上克隆到了煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG1，并證明了NtTTG1與ParA1存在互作關(guān)系。進(jìn)一步研究證明，NtTTG1在ParA