焑草WD40蛋白TTG2對生長發(fā)育和抗病性的調(diào)控作用.pdf

1、生長素和水楊酸是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和抗病防衛(wèi)能力的植物激素。當(dāng)植物受到病原菌侵染時，植物通過調(diào)節(jié)激素信號的交叉對話，從而協(xié)調(diào)生長和抗病性。但如何調(diào)控該交叉對話還不清楚。因此，本博士論文著重解析WD40結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)NtTTG2，具有作為煙草生長素和水楊酸酸交叉對話的調(diào)節(jié)的作用。將有助于進(jìn)一步理解植物防衛(wèi)反應(yīng)的機(jī)制，同時，為闡明植物生長發(fā)育信號通路與植物防衛(wèi)通路的交叉對話提供研究基礎(chǔ)。
　　 1.煙草NtTTG2基因全長cDNA的克

2、隆與序列分析
　　 使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）結(jié)合cDNA末端快速克隆(RACE)技術(shù)，從煙草（Nicotiana tabacum）NC89品種中克隆了煙草表皮毛相關(guān)基因NtTTG2（Nicotiana tabacum Transparent Testa Glabra2），GENBANK登錄號:FJ795022，并對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。NtTTG2全長共1379 bp，開放閱讀框?yàn)?029 bp，預(yù)測其編碼

3、的蛋白質(zhì)序列存在4個WD40重復(fù)(WD40-repeat)的結(jié)構(gòu)域，表明NtTTG2有與其它蛋白質(zhì)結(jié)合的能力。蛋白序列同源性比對結(jié)果顯示，NtTTG2與其他的表皮毛相關(guān)蛋白以及矮牽牛中調(diào)控花瓣色素合成的蛋白AN11有較高的同源性，由此推測NtTTG2與煙草表皮毛的生物學(xué)功能或花色素的合成有關(guān)，實(shí)驗(yàn)表明，NtTTG2在煙草根、莖、葉、花中都有表達(dá)，且在花中表達(dá)量最高。NAA（生長素合成劑）處理煙草后，NtTTG2上調(diào)表達(dá)，但SA處理后表達(dá)

4、下調(diào)。病原菌接種后，NtTTG2表達(dá)受到抑制。NtTTG2定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。
　　 2.NtTTG2激活生長素信號通路但抑制水楊酸信號通路
　　 為了進(jìn)一步研究NtTTG2在煙草中的作用，我們對煙草NtTTG2基因進(jìn)行了沉默和過表達(dá)操作。我們選用了NtTTG23'UTR部分，分別正反向連在載體pBSSK中的內(nèi)含子兩端，成功構(gòu)建了NtTTG2的發(fā)夾沉默載體，同時NtTTG2與35S啟動子相連構(gòu)建了NtTTG2過表達(dá)載體

5、，分別通過葉盤法分別將兩個載體轉(zhuǎn)入煙草NC89中，產(chǎn)生了沉默植株(TTG2iNC)和過表達(dá)植株(TOTNC)。然后檢測轉(zhuǎn)基因植物中TTG2基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與對照(TCNC)相比，TTG2iNC4植株沉默效果較好，TOTNC1基因過表達(dá)效果最好。這為以后的表型分析，生理生化鑒定以及深入研究該基因在煙草信號傳導(dǎo)過程中的作用提供了材料與依據(jù)。生長素信號傳導(dǎo)標(biāo)志基因ARF8的表達(dá)在TCNC、TTG2iNC4和TOTNC1中三個品系中表達(dá)有大

6、的變化，與對照TCNC相比，ARF8在TTG2iNC4的各個器官中幾乎沒有表達(dá)，相反，ARF8在TOTNC1中的表達(dá)高于同期的TCNC。對生長素信號傳導(dǎo)標(biāo)志基因ARF8、GH3和水楊酸信號通路PR-1a、PR-2a的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。RealTime PCR結(jié)果表明，ARF8、GH3在TTG2iNC中的表達(dá)顯著低于TCNC中的表達(dá)，但兩者在TOTNC中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TCNC，尤其是在TOTNC1品系中。PR-1a、PR-2a在TTG2

7、iNC中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TCNC。我們推測NtTTG2激活生長素信號通路并且抑制水楊酸信號通路。
　　 3.NtTTG2通過影響生長素信號通路促進(jìn)煙草生長發(fā)育
　　 生長素調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的幾乎每一個方面，NtTTG2可能通過生長素信號在煙草的生長發(fā)育發(fā)揮了一定的作用。為了驗(yàn)證這一假說，我們首先觀察測量了不同基因型煙草（TTG2iNC4、TOTNC1和TCNC）在MS培養(yǎng)基上的根長及盆栽植株的地上生長情況，并測定了NtTT

8、G2表達(dá)以及EXP1和EXP2的表達(dá)水平，同時對其株高和鮮重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NtTTG2沉默后煙草的EXP1和EXP2表達(dá)降低，煙草生長緩慢。NtTTG2通過調(diào)控DFR和ANS的表達(dá)從而影響花瓣著色，花青素含量降低。NtTTG2沉默后導(dǎo)致煙草敗育種子數(shù)量減少。NtTTG2過表達(dá)后促進(jìn)煙草生長及花瓣著色并且種子數(shù)量增加。綜上所述，我們通過基因沉默和過量表達(dá)的方法，研究了NtTTG2在植物體內(nèi)的功能，發(fā)現(xiàn)它可以促進(jìn)煙草生長，花色素苷的

9、生成，而且可以使煙草的種子數(shù)量增加。同時IAA在TCNC，TTG2iNC4和TOTNC4相同器官里含量相近，說明NtTTG2不影響植物生長素的生成，它通過影響生長素信號的傳導(dǎo)從而影響煙草的生長。
　　 4.NtTTG2抑制SA/NPR1信號通路介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)
　　 為驗(yàn)證NtTTG2在煙草抗病反應(yīng)中是否有重要作用，我們對不同基因型煙草（TTG2iNC4、TOTNC1和TCNC）的葉片分別接種黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花

10、葉病毒(TMV)和大白菜軟腐病菌(Pcc)，并用緩沖液作為對照，隨后對發(fā)病表型進(jìn)行觀察和發(fā)病程度的定量及PR基因的表達(dá)的檢測。結(jié)果表明，與TCNC相比，TTG2iNC4比較抗病，而TOTNC1較為感病。表明NtTTG2對煙草的抗病性具有負(fù)調(diào)控作用。以三生煙為背景產(chǎn)生了NtTTG2過表達(dá)的植株TOTX，及其對照植株TC-Xanthi，并且用病毒介導(dǎo)基因沉默方法得到了以三生煙為背景的TTG2沉默植株的TTG2iX。這些以三生煙為背景的不同基

11、因型接種病原菌后的表型分析更加確定了NtTTG2抑制植物抗病性的作用。煙草NahG（以三生煙為背景）因?yàn)椴环e累水楊酸所以高度感病。我們以的NahG為背景采用病毒介導(dǎo)的基因沉默方法產(chǎn)生了NtTTG2沉默的煙草TTG2i NahG，對三生、NahG和TTG2i NahG煙草接種CMV、TMV和Pcc，正如預(yù)期，TTG2i NahG與Xanthi發(fā)病程度相似，都比NahG表現(xiàn)出一定的抗病性。接種病原物后，根據(jù)病菌生長和發(fā)病癥狀，進(jìn)一步測試了N

12、PR1和TTG2相互作用對抗病性的影響。我們以TC-Xanthi和TTG2iX為背景使用VIGS產(chǎn)生了NPR1沉默煙草NPR1i和TTG2i NPR1i。TTG2i NPR1i1比NPR1i1抗病但比TTG2iX1較感病。因此，NtTTG2和NPR1基因相互拮抗調(diào)節(jié)抗病性。綜上所述，TTG2抑制SA/NPR1信號通路介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)從而負(fù)調(diào)控植物的抗病性。
　　 5.NtTTG2通過影響ARF8和NPR1的核定位而調(diào)節(jié)生長素信號和

13、水楊酸信號通路的下游基因
　　 TTG2是一個典型的WD40結(jié)構(gòu)域蛋白，酵母雙雜交及雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TTG2與ARF8或NPR1在酵母和植物中都不能發(fā)生互作。以帶有RFP標(biāo)簽的TCNC、融合RFP的TTG2過表達(dá)的TOTNC1，及TTG2沉默的TTG2iNC4為材料，瞬時表達(dá)融合黃色熒光蛋白YFP的ARF8和融合綠色熒光蛋白GFP的NPR1;用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白在植物根部的瞬時表達(dá)情況。觀察結(jié)果表明TTG2影

14、響ARF8和NPR1在TCNC，TTG2iNC4和TOTNC1的細(xì)胞定位。ARF8在TOTNC1中主要定位于細(xì)胞核，但在TTG2iNC4只有較弱的熒光，NPR1在TTG2沉默的TTG2iNC4中表現(xiàn)出比對照TCNC更多的定位于細(xì)胞核，同時NPR1蛋白質(zhì)在TOTNC1中定位于細(xì)胞質(zhì)，說明NtTTG2促進(jìn)ARF8定位細(xì)胞核而將NPR1扣留在細(xì)胞質(zhì)中。通過將NPR1和ARF8在TCNC，TTG2iNC4和TOTNC1瞬時表達(dá)后，ARF基因在T