乙烯調(diào)控對大豆?fàn)I養(yǎng)生長與生殖生長影響研究.pdf

1、本研究主要以大豆(Glycine max(L.)merrill)品種鐵豐31為試驗(yàn)材料，研究了大豆生長發(fā)育過程中內(nèi)源乙烯釋放規(guī)律和乙烯生物合成限速酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶(ACS)基因的表達(dá)特征，并通過乙烯生成的促進(jìn)劑1-氨基環(huán)丙烷1-羧酸(ACC)和抑制劑氨基乙氧基乙烯甘氨酸(AVG)的處理，以及利用線性基因的瞬時(shí)表達(dá)體系和RNA干擾技術(shù)研究了乙烯在大豆生長發(fā)育過程中的生理功能。
　　 (1)對大豆不同生長發(fā)育時(shí)期和盛花

2、期不同組織器官乙烯釋放量及其生物合成限速酶ACS基因的表達(dá)特征的研究表明，ACS基因在大豆的整個(gè)生命周期和不同組織器官中都有表達(dá)，但其表達(dá)量存在著明顯的差異。乙烯釋放特征研究的結(jié)果表明，乙烯釋放量在大豆開花后期高于大豆?fàn)I養(yǎng)生長期，在大豆花莢脫落期，乙烯釋放量明顯增加，在大豆的完熟期，乙烯的釋放量達(dá)到最大值；大豆植株相對衰老的組織較幼嫩的組織或器官乙烯釋放量更大。乙烯生物合成限速酶ACS基因的表達(dá)豐度和乙烯生成呈明顯正相關(guān)。利用乙烯合成的

3、促進(jìn)劑ACC和抑制劑AVG對大豆苗期噴施的結(jié)果表明，AVG可促進(jìn)大豆植株的營養(yǎng)生長，且大豆的生育期被提前。AVG處理明顯提高了大豆幼苗葉片凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度，降低了胞間CO2濃度；明顯提高了光飽和點(diǎn)、光飽和光合速率、表觀量子效率、CO2飽和點(diǎn)、羧化效率、RuBP最大再生速率，同時(shí)，降低了光補(bǔ)償點(diǎn)和CO2補(bǔ)償點(diǎn)。此外，AVG處理還提高了生物量和葉面積，但降低了葉綠素含量與氣孔密度。以上結(jié)果表明，外源AVG處理能改善大豆幼苗葉片

4、的光合性能。ACC處理的效果則與AVG相反。
　　 (2)在大豆種子萌發(fā)過程中，胚根突破種皮和下胚軸伸長的兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，ACS基因大量表達(dá)，酶活相應(yīng)提高，乙烯大量釋放。乙烯促進(jìn)劑和抑制劑對大豆種子萌發(fā)的研究結(jié)果表明，AVG處理后乙烯的釋放被顯著抑制，同時(shí)能夠促進(jìn)下胚軸的伸長生長，但是對于大豆的干重沒有顯著影響，同時(shí)下胚軸組織中Zn2+的含量明顯增加；而ACC處理的效果與AVG相反。
　　 (3)通過不同濃度乙烯抑制劑AV

5、G和促進(jìn)劑ACC對大豆花形態(tài)、花粉性狀及單株產(chǎn)量特征等的研究結(jié)果表明，供試品種經(jīng)AVG處理后，與對照相比，成花量、花的長度、花瓣長度、雄蕊柱長、花粉量、花粉管長度、秸桿重、單株莢數(shù)和單株產(chǎn)量有明顯增加，花粉敗育率下降，ACC處理的效果與AVG相反。兩種處理對大豆花粉萌發(fā)率無明顯影響?；ǚ蹝呙桦婄R結(jié)果顯示，AVG處理的花粉長度增加，ACC處理的花粉部分出現(xiàn)扭曲與變形。
　　 (4)通過洋蔥下表皮和大豆子葉節(jié)部位最小線性表達(dá)框的直接

6、轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)了線性元件在洋蔥下表皮和大豆子葉節(jié)部位的基因瞬時(shí)表達(dá)。GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)和5’-FITC標(biāo)記DNA的示蹤，表明外植體的高滲預(yù)處理有利于線性DNA的直接轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)表達(dá)；向轉(zhuǎn)化緩沖液中添加包括Ca2+，表面活性劑和農(nóng)桿菌LBA4404的細(xì)胞培養(yǎng)物也有利于提高基因的瞬時(shí)表達(dá)效率。FITC-DNA的熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，外植體于黑暗培養(yǎng)3h后通過線性DNA基本轉(zhuǎn)化緩沖液的轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)72h后，細(xì)胞核中能觀察到較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。流式細(xì)

7、胞技術(shù)檢測表明在以MS液體培養(yǎng)基為基本轉(zhuǎn)化緩沖液的條件下，線性DNA的入核效率僅為0.02％，當(dāng)基本緩沖液同時(shí)添加Ca2+、Dow Comning Q2-5211和農(nóng)桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，入核效率由0.02％增加至54.85％。
　　 (5)構(gòu)建大豆ACC合酶基因GMACS保守區(qū)域的RNA干擾(RNAi)載體，進(jìn)行了大豆子葉節(jié)部位線性ACS-RNAi基因表達(dá)框的轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)表達(dá)研究，PCR、RT-PCR檢測和瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明，線性AC

8、S基因的表達(dá)框轉(zhuǎn)化進(jìn)入大豆子葉節(jié)部位。轉(zhuǎn)化后子葉節(jié)部位乙烯的釋放和ACS基因的表達(dá)被抑制，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照相比，轉(zhuǎn)化處理的大豆子葉節(jié)部位能夠分化出更多花芽。
　　 綜上結(jié)果表明，乙烯直接影響大豆生長發(fā)育的全過程。大豆種子萌發(fā)過程中，乙烯的三重反應(yīng)主要與乙烯調(diào)控的無機(jī)離子特別是2n2+的轉(zhuǎn)運(yùn)和生物有效性相關(guān)。抑制乙烯生成可以增強(qiáng)大豆的光合性能、促進(jìn)營養(yǎng)生長、增加大豆的成花數(shù)量、提高大豆的產(chǎn)量，為大豆的高產(chǎn)栽培和育種提供了重要