OLA1作為整合應激反應調控因子對腫瘤生長轉移的影響.pdf

1、目的：
　　Weinberg等提出了腫瘤的幾個標志性特征:自給自足的生長信號，抗增長抑制和細胞死亡的能力，血管生成和無限制自我復制能力，侵襲和轉移能力，逃避免疫殺傷，誘導炎癥發(fā)生，細胞能量異動以及基因組的不穩(wěn)定性和突變性。事實上，腫瘤細胞生存在一個動態(tài)變化中的微環(huán)境里面。腫瘤的快速生長能力會誘導大量的細胞內來源或者細胞外來源的壓力的產(chǎn)生。當腫瘤的生長速度超過血液供應速度的時候，就會出現(xiàn)養(yǎng)料和氧氣匱乏的現(xiàn)狀。雖然腫瘤細胞對此具有一定

2、的耐受能力，但細胞內的能量代謝會受到抑制，細胞可能因此死亡。缺氧會導致細胞核內DNA降解，導致細胞壞死或凋亡的出現(xiàn)。應激反應發(fā)生后，細胞內質網(wǎng)內會激活未折疊蛋白反應(UPR)從而減輕內質網(wǎng)負荷，持續(xù)性蛋白質合成的抑制會造成細胞的生長停滯。一般情況下，癌細胞是處在氧化應激環(huán)境下。過量的活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生會引起細胞死亡。面對如此之多的各種不利的內外壓力，腫瘤細胞已經(jīng)形成了一套稱之為整合應激反應(ISR)的應激反應系統(tǒng)。真核生物翻譯起始

3、因子2α(eIF2α)在整合應激反應中發(fā)揮重要作用。eIF2a的磷酸化會抑制蛋白質合成，但同時也會增強了一些特殊蛋白的翻譯，如活化轉錄因子4(ATF4)。ATF4表達的上調將開啟整合應激反應系統(tǒng)中一系列基因的轉錄程序。比如天冬酰胺合成酶(ASNS)和轉錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)。整合應激反應有助于腫瘤細胞耐受各種壓力環(huán)境。與此同時，整合應激反應的持續(xù)活化又可以通過蛋白質合成的抑制和細胞凋亡的激活造成細胞死亡。
　　OLA

4、1，Obg like ATPase1，被認為在細胞蛋白質翻譯和降解過程中發(fā)揮調控作用。但是，對其功能和相關機制的認知甚少。在本文里面，我們提出OLA1是作為整合應激反應的一個新的調控因子，OLA1的表達對乳腺癌的發(fā)展具有重要作用。
　　方法和結果：
　　本位主要以乳腺癌細胞系231-D3H2-LN(MDA-MB-231-luc-D3H2LN)作為對象研究了OLA1蛋白對腫瘤生長轉移能力的影響以及OLA1在整合應激反應(ISR

5、)中的調控作用。研究內容主要包括三個部分:（一）OLA1對腫瘤細胞體內生長轉移的影響;（二）體外實驗研究OLA1對細胞壓力應激反應的調控以及OLA1的下游調控蛋白;（三）OLA1作為乳腺癌的一個預后指標的可行性研究。
　　（一）OLA1對腫瘤細胞體內生長轉移的影響
　　利用慢病毒感染構建231-D3H2-LN OLA1表達敲低的穩(wěn)定細胞株以及對照組。將細胞等量注射到裸鼠脂肪墊。三周后， OLA1敲低表達腫瘤組生長速度明顯快于

6、對照組。有趣的是，體外實驗表明OLA1對腫瘤細胞生長的影響是很小的。第二次動物實驗中，我們在SCID小鼠的脂肪墊上接種231-D3H2-LN穩(wěn)定細胞株。IVIS（體內成像系統(tǒng)）結果發(fā)現(xiàn)，OLA1敲低組中的淋巴結轉移比率為84.6％(11/13)，超過了對照組的38.5％(5/13)。組織病理學研究進一步確認小鼠淋巴結和肺的轉移情況。我們發(fā)現(xiàn)，OLA1低表達組中發(fā)生了更多的淋巴結轉移(20個，對照組9個)和肺轉移（6例，對照組2例）。OL

7、A1表達的下調會增強腫瘤轉移能力。Western blot研究腫瘤組織中的蛋白質表達情況。我們發(fā)現(xiàn)在OLA1敲低腫瘤中，p-GSK-3β，p-p70S6K，p-eIF2α，ASNS和CHOP的表達下調。免疫組化染色證實了OLA1的下調會引起CHOP表達的降低以及細胞凋亡的減少。Ki67染色結果則顯示， OLA1的表達與對細胞增殖沒有影響。OLA1的抑制對乳腺癌細胞在體內生長和轉移具有促進作用，同時會影響腫瘤ISR通路中相關蛋白表達的變化

8、。
　?。ǘw外實驗研究OLA1對細胞壓力應激反應的調控以及相關下游調控蛋白
　　為進一步研究OLA1對腫瘤細胞整合應激反應的影響，體外實驗中我們對231-D3H2-LN穩(wěn)定細胞株進行血清饑餓處理，氨基酸饑餓處理，內質網(wǎng)應激反應誘導處理(tunicamycin)或氧化應激誘導處理(H2O2)。相比較對照組，OLA1表達敲低組細胞更能耐受各種壓力，細胞的存活比例也更高。Western blot結果表明，血清饑餓處理72小時后

9、，OLA1低表達組中，p-eIF2α和p-GSK-3β的水平顯著降低。在氨基酸饑餓條件下，OLA1敲低組中GCN2-p-eIF2α-ATF4表達水平明顯低于對照組。同樣的，在內質網(wǎng)應激或氧化應激條件下，OLA1低表達組里面觀察到下調的PERK-p-eIF2α-ATF4-ANSN。35S標記方法是用來檢測細胞中蛋白質的翻譯速率。在血清饑餓或內質網(wǎng)應激條件下，OLA1敲低231-D3H2-LN細胞株中蛋白合成水平顯著增高。以上結果表明，OL

10、A1的抑制會降低乳腺腫瘤細胞整合應激反應通路中相關蛋白的表達并增強乳腺癌細胞在壓力條件下的生存能力。OLA1-rescue實驗進一步驗證了這個觀點。在OLA1敲低表達的穩(wěn)定細胞株中，我們利用質粒轉染方法將OLA1表達上調。結果發(fā)現(xiàn)，OLA1表達的回升同時伴隨著整合應激反應通路中PERK-eIF2α-ATF4表達的上調。在進一步的免疫共沉淀(IP)實驗中我們發(fā)現(xiàn)，OLA1與eIF2α蛋白之間具有直接的相互作用。
　　（三）OLA1作

11、為乳腺癌的一個預后指標的可行性研究
　　采用免疫組織化學方法對160例乳腺癌臨床標本進行了OLA1蛋白表達情況的檢測，結合臨床病理資料及隨訪情況分析。Kaplan-Meier生存曲線表明，OLA1的低表達組中乳腺癌的復發(fā)時間更早（log-rank: P=0.024），乳腺癌患者術后生存更差（log-rank: P=0.033）。多因素Cox比例風險模型分析表明，OLA1的表達水平和乳腺癌的復發(fā)風險(HR:0.540，95％CI:0

12、.345-0.844，P=0.007)，乳腺癌患者的術后死亡風險(HR:0.514，95％CI:0.292-0.905，P=0.021)均呈現(xiàn)負相關關系。OLA1的低表達預測預后不良的乳腺癌患者。
　　結論：
　　截止到現(xiàn)今，關于OLA1機制的研究少之又少，其中多數(shù)集中在原核生物中。實際上，OLA1的表達對真核生物，對腫瘤細胞的內部各種機理的調控是極為重要的。OLA1不僅會影響細胞內蛋白合成，還會調控腫瘤細胞內整合應激反應(

13、ISR)信號通路的改變。
　　1.本文第一次提出了OLA1作為腫瘤細胞整合應激反應的潛在的一個調控因子。OLA1的敲低會引起腫瘤細胞中ISR通路中相關蛋白的下調，同時提高細胞對體外各種壓力刺激的耐受能力和生存能力。進一步的，細胞內OLA1和eIF2α蛋白是直接互相結合的，提示了OLA1是如何影響ISR通路的變化。
　　2.本文第一次檢測了OLA1對乳腺癌細胞在小鼠體內生存和轉移能力的影響。OLA1對腫瘤細胞在體外生長的影響不