JSRV檢測(cè)及JSRV轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)基因LTR致瘤機(jī)制相關(guān)性研究.pdf

1、綿羊肺腺瘤病（ovine pulmonary adenomatosis，OPA）是一種綿羊肺腺瘤病病毒（jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）導(dǎo)致的肺腺泡樣腫瘤性疾病，病原JSRV為β—反轉(zhuǎn)錄病毒，國(guó)際獸疫局（OIE）將該病列為B類傳染病。在國(guó)內(nèi)，該病目前主要依靠常規(guī)病理學(xué)方法檢測(cè)診斷，嚴(yán)重障礙了我國(guó)OPA的快速診斷和防控，同時(shí)，對(duì)綿羊肺腺瘤病的發(fā)病機(jī)理尚有很多不清楚的地方。為了進(jìn)一步研究JSRV的致病機(jī)制及

2、建立快速診斷OPA的方法，本研究在綿羊肺腺瘤病流行病學(xué)，病理學(xué)研究的基礎(chǔ)上，以獲得的3株抗JSRV—CA蛋白的單克隆細(xì)胞分泌的McAb為一抗，應(yīng)用Western blot進(jìn)行肽探針掃描，以鑒定三株單抗識(shí)別的線性表位；并應(yīng)用非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法測(cè)定三株單抗的功能性親和常數(shù)，篩選合適的單抗，用于建立基于JSRV—CA的血清學(xué)診斷法。以陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)病料與健康陰性羊肺組織為樣本，比較陰性、陽(yáng)性樣本對(duì)JSRV—CA重組蛋白與抗JSRV—CA單抗的阻斷

3、率的差異，首次在國(guó)內(nèi)建立了綿羊肺腺瘤病的阻斷ELISA方法，并對(duì)該方法的特異性及臨床應(yīng)用作了檢測(cè)。 同時(shí)，應(yīng)用生物學(xué)軟件ClustaIW（1.8）對(duì)內(nèi)源性JSRV（enjSRV）與外源性JSRV（exjSRV）進(jìn)行序列對(duì)比，針對(duì)兩者差異顯著的LTRU3區(qū)設(shè)計(jì)了特異性引物，在國(guó)內(nèi)首次建立了特異性PCR及套式PCR檢測(cè)exjSRV的方法。在700ng健康羊基因組DNA的背景下，梯度稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒pJSRV LTR為參照，對(duì)兩種PCR方

4、法的敏感性進(jìn)行比較，并以建立的方法對(duì)臨床病料進(jìn)行檢測(cè)。為研究JSRV轉(zhuǎn)錄起始/調(diào)節(jié)基因（LTR）與病毒致瘤機(jī)制的相關(guān)性，需高純度、高活力的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及enjSRV/exjSRV LTR作為研究材料。本研究采用IgG黏附法結(jié)合磁化樹(shù)脂微粒法分離并純化了山羊肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，并應(yīng)用堿性磷酸酶（AKP）結(jié)合核固紅染色鑒定細(xì)胞的純度，應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞的活力。此外，克隆了JSRV的內(nèi)外源性LTR，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。用生物學(xué)軟件DNAs

5、tar，MatInspector比較了LTR U3區(qū)的同源性及細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的差異，并基于U3區(qū)的核苷酸序列，用生物學(xué)軟件Mega繪制了JSRV LTR系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹(shù)。在獲得了肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及enJSRV/exJSRV LTR的基礎(chǔ)上，應(yīng)用雙螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)，比較了綿羊，山羊enJSRV LTR與綿羊exJSRVLTR在不同細(xì)胞內(nèi)的啟動(dòng)子活性。此外，分別缺失突變了LTR的Gfi—Ⅰ、C/EBP、HNF—3β等三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合

6、位點(diǎn)，比較了綿羊exJSRV LTR與突變后exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)子活性的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：（1）本研究建立的ELISA法以阻斷率為37％作為陰性與陽(yáng)性判斷的臨界點(diǎn)，可以明確區(qū)分感染JSRV的陽(yáng)性病料與健康陰性對(duì)照。所建立的PCR檢測(cè)方法中，套式法的敏感性是一步法的10倍以上，可檢測(cè)出樣本中1～10拷貝的JSRV，同步檢測(cè)結(jié)果表明，以上的血清學(xué)和PCR檢測(cè)方法與臨床病理組織學(xué)診斷的結(jié)果高度一致。（2）本研究分離純化

7、的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞純度為90％以上（AKP染色法），活細(xì)胞為95％以上（臺(tái)盼藍(lán)染色法）。（3）將本研究克隆測(cè)序的enJSRV/exJSRV LTR與GenBank上發(fā)表的其它JSRV LTR序列進(jìn)行了系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹(shù)分析，表明本研究克隆的enJSRV/exJSRV LTR分支明顯，且現(xiàn)有的enJSRV/exJSRV LTR在病毒與宿主共進(jìn)化的過(guò)程中分別演化出2個(gè)不同的分支。本研究克隆的我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)JSRV流行株與歐美毒株有較近的親緣關(guān)系

8、。（4）雙熒光素酶分析試驗(yàn)表明，除肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞外，enJSRV/exJSRV LTR在各細(xì)胞內(nèi)的啟動(dòng)子活性差異較小，而exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)相對(duì)活性為其他細(xì)胞內(nèi)相對(duì)活性的24—230倍。分別缺失突變C/EBP、HNF—3β轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的綿羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)的啟動(dòng)子活性下降約60％—70％。 以上結(jié)果表明：JSRV病毒粒子及exJSRV序列在肺腫瘤組織中含量高，是臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的理

9、想材料，而外周血白細(xì)胞中亦含有exJSRV序列，需用高敏感的套式PCR作檢測(cè)。exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出高活性，說(shuō)明綿羊exJSRV LTR對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞具有特殊嗜性。此外，缺失轉(zhuǎn)錄因子C/EBP、HNF—3β結(jié)合位點(diǎn)顯著影響綿羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)的啟動(dòng)子活性，說(shuō)明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)綿羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)的特殊嗜性具有重要作用。本研究建立的特異性實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)JSRV