JSRV-NM株env基因和CA基因的克隆、表達(dá)及其單抗的制備.pdf

1、綿羊肺腺瘤病(sheep pulmonary adenomatosis，SPA)是由β-反轉(zhuǎn)錄病毒屬，綿羊肺腺瘤病病毒(jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV)引起的一種肺腫瘤性疾病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為B類傳染病。 為了進(jìn)一步研究JSRV的致病機(jī)制及建立快速診斷SPA的方法，本研究對(duì)內(nèi)蒙古某市種羊場(chǎng)綿羊肺腺瘤病進(jìn)行流行病理學(xué)研究的基礎(chǔ)上，從綿羊肺腺瘤病病毒內(nèi)蒙株(JSRV-NM)自然感染羊的肺腫瘤

2、組織中提取基因組DNA，根據(jù)JSRV-NM株基因組全序列，采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，在env基因的表面蛋白(SU)及跨膜蛋白(TM)基因和gag基因的衣殼蛋白(CA)基因設(shè)計(jì)引物，經(jīng)體外重組技術(shù)分別進(jìn)行克隆、構(gòu)建重組質(zhì)粒并測(cè)序分析變異情況，再分別亞克隆至原核表達(dá)載體，在大腸桿桿菌系統(tǒng)中表達(dá)蛋白；將CA基因C末端融入HA序列，再亞克隆至真核表達(dá)載體上，在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。以原核表達(dá)CA蛋白的純化產(chǎn)物免疫BAL

3、B/c小鼠，制備其單克隆抗體(McAb)，以原核表達(dá)產(chǎn)物與真核表達(dá)產(chǎn)物篩選、鑒定制備的McAb。同時(shí)，對(duì)SPA自然病例和人工感染病例，用所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time Q-PCR)方法檢測(cè)其外周血白細(xì)胞、肺臟、肺門淋巴結(jié)及鼻液中JSRV-NM株前病毒拷貝數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： (1)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEM-T-CA、pGEM-T-SU和pGEM-T-TM，分別經(jīng)測(cè)序分析結(jié)果顯示，CA基因與JSRV-NM株比較氨基酸序列同源性

4、可達(dá)99.45％；SU基因所編碼的氨基酸共有8處發(fā)生突變，同源性為97.36％；TM基因核苷酸序列發(fā)生很多突變和終止密碼子，與JSRV-NM株序列中該段序列同源性僅為80.2％，這些缺陷型前病毒的大量存在可能與免疫保護(hù)存在一定的關(guān)系，有待進(jìn)一步研究；與內(nèi)源性enJSRV的TM部分序列進(jìn)行比較結(jié)果顯示，其氨基酸序列中具有外源性exJSRV特有的致病性“YXXM”序列。(2)重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-CA和pGEX-4T-1-SU

5、及pGEX-4T-1-TM可以在大腸桿菌中分別以可溶性和包涵體形式高效表達(dá)，表達(dá)的CA、SU和TM融合蛋白表觀分子量分別約為37KD<,a>、68KD<,a>和46KD<,a>，表達(dá)量分別占全菌蛋白的20％、25％和30％，并利用谷胱甘肽Sepharose 4B親和層析柱純化可溶性表達(dá)蛋白和從包涵體分離純化得到的表達(dá)蛋白具有較高純度，是一種理想的免疫原。(3)構(gòu)建的重組真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)-CA-HA，轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞和H

6、ela細(xì)胞后，用Anti-HA單抗經(jīng)間接免疫熒光和Westhem blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示該載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，可在細(xì)胞內(nèi)觀察到特異性熒光和檢測(cè)到目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。說(shuō)明已成功地構(gòu)建了CA蛋白的真核表達(dá)載體，并可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CA目的基因。(4)用原核表達(dá)CA蛋白的純化產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得3株能穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞。利用CA真核表達(dá)蛋白分別對(duì)此3株雜交

7、瘤細(xì)胞經(jīng)間接免疫熒光方法鑒定，結(jié)果證實(shí)所獲得的3株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體均為針對(duì)JSRV-NM株CA蛋白的特異性McAb。(5)根據(jù)JSRV-NM株env基因序列，選取其保守序列作為檢測(cè)的目的片段，設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物和TaqMan探針，以SPA自然病例的肺腫瘤組織基因組DNA為模板，用PCR方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T-Env，并嚴(yán)格定量后，梯度稀釋作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化反應(yīng)條件后進(jìn)行real-time Q-PCR擴(kuò)增，獲得相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

8、為：Y=-3.308X+47.848，線性相關(guān)系數(shù)為0.991；經(jīng)同一標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)，C<'t>值變異系數(shù)小，并且靈敏度比常規(guī)PCR高10-100倍。因此初步建立了檢測(cè)JSRV前病毒DNA的real-time Q-PCR技術(shù)平臺(tái)。(6)應(yīng)用初步建立的real-time Q-PCR方法對(duì)不同來(lái)源的綿羊外周血樣品及其他組織樣品進(jìn)行初步地檢測(cè)，測(cè)定其前病毒載量。結(jié)果顯示B組和C組外周血白細(xì)胞、肺臟、肺門淋巴結(jié)以及鼻液中檢測(cè)前病毒DNA均為陽(yáng)性，

9、并發(fā)現(xiàn)前病毒DNA的載量在肺臟中明顯高于外周血白細(xì)胞，高達(dá)10～1000個(gè)拷貝：D組雖未發(fā)現(xiàn)有SPA臨床癥狀，但在肺門淋巴結(jié)里可以檢測(cè)到前病毒DNA；E組中一只綿羊的肺臟也檢出低拷貝數(shù)的前病毒DNA，而在A組中檢測(cè)結(jié)果均為陰性。 本研究是國(guó)內(nèi)首次對(duì)JSRV進(jìn)行相關(guān)蛋白的分子克隆與表達(dá)研究、單克隆抗體的制備以及real-time Q-PCR檢測(cè)，對(duì)SPA分子發(fā)病機(jī)理進(jìn)一步研究及建立更為靈敏的檢測(cè)JSRV的特異性方法以及研究SPA防