JSRV表面蛋白抗原表位的篩選及檢測試劑盒的制備.pdf

1、研究背景：綿羊肺腺癌（ovine pulmonary adenocarcinoma，OPA）是由β-反轉(zhuǎn)錄病毒屬綿羊肺腺瘤病病毒(jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）引起的一種傳染性肺臟腫瘤性疾病，世界動物衛(wèi)生組織將其列為 B類傳染病。目前國內(nèi)對該病的診斷主要依靠常規(guī)病理學(xué)方法檢測，嚴(yán)重障礙了我國對OPA的防控。
　　主要目的：建立快速特異的實驗室及適用于基層的診斷方法，為臨床及基層檢測診斷提供技術(shù)支

2、持，為進(jìn)一步分析表面蛋白(surface protein,SU）蛋白的功能、疫苗設(shè)計及對 JSRV的生物學(xué)特性研究提供素材。
　　研究方法：以獲得的三株抗 JSRV-SU蛋白的單克隆細(xì)胞分泌的McAb為一抗，應(yīng)用噬菌體展示結(jié)合肽探針掃描技術(shù)，鑒定三株單抗所識別的線性表位；并應(yīng)用非競爭性 ELISA法測定三株單抗的功能性親和常數(shù)；以陽性標(biāo)準(zhǔn)病料與健康陰性羊肺組織為樣本，以純化的多抗和單克隆抗體為基本檢測試劑，建立雙抗體夾心 ELIS

3、A檢測方法；針對外源性 JSRV U3區(qū)設(shè)計特異性引物，建立 JSRV的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediatedisothennala mplification,LAMP）檢測方法，并以700ng健康羊基因組 DNA為背景進(jìn)行敏感性和特異性試驗；通過基因克隆技術(shù)對 JSRVenv及綿羊 ras基因進(jìn)行序列測定；運用基因重組方法構(gòu)建 JSRVenv重組真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
　　研究結(jié)果：
　　1

4、.三株單抗3B3、3D6、1D6的親和常數(shù)分別為5.06×109 L/mol﹑5.82×109 L/mol﹑2.91×109 L/mol；且其所對應(yīng)的抗原表位分別為W156APEGTPD163，F(xiàn)71SYQSQHPHCI81，D98EKTGKR104；
　　2.首次基于JSRV-SU蛋白的單抗建立了夾心 ELISA法，并建立了陰性與陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)（當(dāng) P/N≥2.21時判為陽性；當(dāng) P/N<1.85時判為陰性；當(dāng)2.21>P/N≥

5、1.85時判為可疑）；
　　3.在國內(nèi)首次基于內(nèi)外源性病毒長末端重復(fù)序列(long terminal repeat,LTR）的差異建立了 LAMP診斷方法，所建立的反應(yīng)體系在恒溫水浴鍋中作用60min即可得到其特有的階梯狀條帶，而且對內(nèi)源性 JSRV的擴增結(jié)果為陰性，該方法對 JSRV前病毒 DNA的最小檢測限為10拷貝，靈敏性高于一步 PCR方法。LAMP和特異性 PCR及套式 PCR方法檢測臨床樣品的符合率分別為92％和100

6、%；
　　4.通過基因克隆技術(shù)對 JSRVenv及綿羊 ras基因進(jìn)行序列測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究克隆的pMD-exJSRVenv1屬于Ⅱ型 exJSRV；而 pMD-exJSRV env2屬于Ⅰ型 exJSRV；在 exJSRV氨基酸序列中存在“YXXM”基序；綿羊ras基因與已知其他物種的該段基因作比對差異率較小，基本保守，且與牛的ras基因同源性最高；
　　5.成功構(gòu)建了含有env及 tm基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDN

7、A3.1-env及 pcDNA3.1-TM-HA，并建立了穩(wěn)定表達(dá) JSRV囊膜蛋白（Env）及其 TM亞基的HepG2細(xì)胞系。
　　結(jié)論：本研究建立了特異性檢測 JSRV的夾心 ELISA法和LAMP法，對于我國養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展，具有重要的實用價值，對研究 OPA防制措施等均有重要意義。另外，JSRV env基因的克隆和表達(dá)及對綿羊 ras基因的序列分析，對于豐富 JSRV的分子發(fā)病機理以及為進(jìn)一步研究該蛋白與JSRV誘導(dǎo) OP