嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白檢測試劑盒的制備及其臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:1.制備雙抗夾心ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay，酶聯(lián)免疫吸附試驗)嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(eosinophiliacationicprotein，ECP)檢測試劑盒。2.對不同的包被方法進(jìn)行比較。3.評估ECP水平檢測在過敏性疾病診療中的意義。 方法:1.雙抗夾心ELISAECP檢測試劑盒的制備：(1)葡萄球菌A蛋白親和層析法純化抗-ECP單克隆抗體(monoclonalantib

2、ody，mAb)，(2)過碘酸鈉法HRP標(biāo)記抗-ECP多克隆抗體(polyclonalantibody，pAb)，(3)ELISA試劑盒的制備與條件優(yōu)化，(4)實驗效能評價。 2.ECP檢測試劑盒的方法學(xué)比較：(1)抗-ECPmAb的生物素化，(2)BSA的生物素化，(3)先包被生物素的ELISA試劑盒的制備與條件優(yōu)化，(4)先包被親和素的ELISA試劑盒的制備與條件優(yōu)化，(5)比較三種檢測方法。 3.評估ECP水平檢測

3、對過敏性疾病診療的意義：(1)評估采血方式對ECP結(jié)果的影響，(2)評估ECP檢測對過敏性皮膚病診療的意義：檢測過敏性皮膚病患者血清ECP水平；檢測患者總IgE水平，并評估其與ECP的相關(guān)性；評估蕁麻疹患者治療前后ECP水平的變化，以及其ECP水平與癥狀評分、總IgE、特異性IgE相關(guān)性；評估異位性皮炎患者疾病癥狀評分與ECP水平、總IgE、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)計數(shù)的相關(guān)性。4.評估ECP水平檢測在過敏性鼻炎診療中的意義。 結(jié)

4、果:1.雙抗夾心ELISAECP檢測試劑盒的制備：(1)通過對該方法中各種反應(yīng)條件的摸索和優(yōu)化，確定了最適工作條件：單抗最適包被濃度1:500稀釋，酶標(biāo)多抗最適濃度為1:8000稀釋，最佳封閉液為1％的BSA，最適血清稀釋液為稀釋液II，最佳反應(yīng)時間為60min，反應(yīng)溫度為37℃。(2)本研究制備的試劑盒線性范圍為2.5～200ng/ml，靈敏度為2.75ng/ml，相對偏差為11.5％，批內(nèi)變異系數(shù)<10％，批間變異系數(shù)<15％，穩(wěn)定

5、性較好，與ADL試劑盒相比較相關(guān)系數(shù)為0.97。 2.三種方法的比較：(1)生物素親和素包被法線性范圍為2.5～500ng/ml，靈敏度為2.61n咖l，相對偏差為10.9％；(2)親和素包被法線性范圍為2.5～500ng/ml，靈敏度為2.68ng/ml，相對偏差為11.9％。(3)三種方法的重復(fù)性、精確性沒有顯著性差異，穩(wěn)定性親和素包被法最為穩(wěn)定，抗體包被法次之，生物素包被法最不穩(wěn)定，抗體直接包被法操作最為簡易，但抗體用量最

6、多。 3.ECP水平檢測對過敏性疾病診療的意義：(1)標(biāo)本采集后37℃放置1h的結(jié)果顯著高于室溫與0℃組，抗凝劑對ECP水平無影響，而標(biāo)本溶血使ECP水平顯著升高。(2)過敏性皮膚病患者血清ECP水平高于正常對照組(P<0.01)，總IgE水平高于正常值(P<0.05)，二者無相關(guān)性；蕁麻疹患者治療前后ECP水平有顯著差異(P<0.05)，且ECP水平與癥狀評分、特異性IgE呈正相關(guān)；異位性皮炎患者疾病癥狀評分與ECP水平呈正相