JSRV囊膜蛋白及其亞基誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化與分子發(fā)生機制的研究.pdf

1、研究背景:綿羊肺腺瘤(ovine pulmonary adenomatosis，OPA)是由綿羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV)引起的一種慢性、傳染性綿羊肺臟腫瘤疾病。JSRV屬于β逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，基因組主要包含病毒的結構基因gag、 pro、pol和env。其中env是一個癌基因，它的表達產(chǎn)物囊膜蛋白(Env)由表面蛋白(SU)和穿膜蛋白(TM)兩個亞基組成，彼此間以二硫鍵相連。JSRV的受

2、體為透明質(zhì)酸酶2（Hyaluronoglucosaminidase2，Hyal-2）。由于NIH3T3細胞具有強烈的接觸抑制特性，能根據(jù)失去接觸抑制而明確地識別已發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞，故作為一種重要的細胞用于JSRV致瘤機制的研究。近年的研究顯示，單獨表達JSRV Env對于誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化是必須和充分的，但其具體的轉(zhuǎn)化分子機制中仍存在一些值得探討的地方。
　　研究目的:進一步探究JSRV Env及其亞基（SU和TM）誘導NIH

3、3T3細胞轉(zhuǎn)化的分子機制，這對于深入闡明OPA的分子發(fā)病機制及確定相應的防控靶點，具有重要的理論意義和潛在的應用價值。
　　研究方法:
　　1.應用RT-PCR的方法從綿羊瘤胃組織總RNA中擴增Hyal-2的編碼序列，構建含有綿羊Hyal-2基因編碼區(qū)的真核表達質(zhì)粒。將該真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，經(jīng)G418篩選、純化后，以制備穩(wěn)定表達綿羊Hyal-2受體的NIH3T3細胞系。
　　2.采用JSRV Env及其亞

4、基真核表達質(zhì)粒分別誘導轉(zhuǎn)化NIH3T3細胞和穩(wěn)定表達綿羊Hyal-2受體的NIH3T3細胞系，并檢測比較各轉(zhuǎn)染組與空白對照組間，細胞的接觸抑制特性、非錨定依賴性生長能力、增殪活性以及磷酸化Akt含量的差異。
　　3.設計小鼠源kras、nras、egfr、 p53和pik3ca腫瘤相關基因常見突變所在外顯子的突變點檢測引物，采用PCR-SSCP和核酸測序分析法檢測JSRV Env及其亞基誘導轉(zhuǎn)化細胞中腫瘤相關基因的突變情況。

5、>　　4.以內(nèi)蒙古地區(qū)OPA自然病例的肺組織總DNA為模板，克隆JSRV前病毒的gag、 pro與pol基因，并應用雙酶切的方法將其與已有的LTR、env基因連接起來，以獲得含有JSRV前病毒全基因組的重組質(zhì)粒。
　　研究結果:
　　1.成功構建了含有綿羊Hyal-2基因編碼區(qū)的真核表達質(zhì)粒pcDNA-Hyal2-HA，并建立了穩(wěn)定表達綿羊Hyal-2受體的NIH3T3細胞系。
　　2.在NIH3T3細胞中，Env及T

6、M具有誘導細胞轉(zhuǎn)化、激活Akt的能力;而在穩(wěn)定表達綿羊Hyal-2受體的NIH3T3細胞系中，僅TM具有這樣的能力。
　　3.在JSRV Env及其亞基誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化的過程中，腫瘤相關基因kras、nras、egfr、 p53和pik3ca均未發(fā)生突變。
　　4.成功構建了包含外源性JSRV前病毒基因組全長的重組質(zhì)粒pMD-JSRV。核酸序列分析結果表明，本研究重組克隆的pMD-JSRV基因組全長7690 bp，具

7、外源性JSRV典型的分子特征，屬JSRV-Ⅱ型，與分離自美國的代表株AFI05220親緣關系較近，同源性達95％。
　　結論:
　　1.本研究成功構建了穩(wěn)定表達綿羊Hyal-2受體NIH3T3細胞系。
　　2.在JSRV Env誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化并激活Akt的過程中，其TM亞基起到了主要作用，并且TM亞基還具有單獨誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化的能力。
　　3.綿羊Hyal-2具有抑制JSRV Env誘導NIH3