大腸癌mtDNA誘導NIH3T3細胞惡性轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學碩士學位論文大腸癌mtDNA誘導NIH3T3細胞惡性轉(zhuǎn)化的研究姓名：姬宏莉申請學位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學（消化系病）指導教師：肖冰20070510中文摘要D一環(huán)區(qū)包括重鏈的復制起點等重要序列，成為研究熱點。本課題組前期已完成以大腸癌細胞／組織、癌旁正常組織以及大腸癌患者和正常人外周血白細胞為對照，通過PCR、PcR—SscP等技術(shù)分析大腸癌細胞／組織以及癌旁組織、大腸癌患者外周血白細胞mtONA變異，包括點突變、缺失、DNA

2、的不穩(wěn)定性等變化的特征及規(guī)律；并構(gòu)建人大腸癌細胞及正常人血白細胞線粒體DNA重組表達載體。本課題旨在通過將大腸癌細胞突變的mtDNA片斷轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3)，觀察轉(zhuǎn)染細胞的mDNA改變的特點和mtDNA片段在成纖維細胞核內(nèi)的整合情況，及進一步觀察轉(zhuǎn)染細胞生物學行為的改變，并把轉(zhuǎn)染細胞接種于裸鼠，觀察轉(zhuǎn)染細胞的致瘤作用及mtDNA在成瘤細胞核內(nèi)的整合。以便明確變異的mt蜊A造成大腸癌發(fā)病的機制和作用。方法1通過雙酶切和單

3、酶切，ABl377測序儀全自動正反雙向測序，并與線粒體基因庫數(shù)據(jù)對照(http／／wwwncbinlmnihgov／BLAST／)，鑒定已構(gòu)建的突變的大腸癌pcDNA31()一$w480mtDNA、pcDNA31()一LovomtDNA、pcDNA31()一NhWBCmtDNA重組載體及pcDNA3。l()空載體。2通過脂質(zhì)體法(1ipofection2000TM)，將大腸癌細胞突變的mtONA真核表達載體轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，利用G4

4、18抗性篩選；用熒光標記的染色體原位雜交(FISH)觀察mtONA在核內(nèi)豹整合情況；觀察轉(zhuǎn)染前后細胞異型性及進行染色體核型分析；PCR法檢測轉(zhuǎn)染細胞線粒體突變情況；流式細胞儀(FCM)檢測轉(zhuǎn)染細胞的凋亡情況：用四唑鹽比色法(啪盯)測定在不同時間、不同組問細胞增殖的吸光度值，用SPSSIO0軟件，定量數(shù)據(jù)重復測量的方差分析法，進行統(tǒng)計學分析。3將穩(wěn)定陽性克隆細胞株接種于BALB／C裸鼠皮下，觀察轉(zhuǎn)染細胞的致瘤作用。結(jié)果1已構(gòu)建的真核表達載