玉米黏蟲轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究及RNAi機(jī)制相關(guān)基因的克隆.pdf

1、玉米黏蟲屬于鱗翅目夜蛾科，是一類雜食性和暴食性農(nóng)業(yè)害蟲，可危害糧食、經(jīng)濟(jì)作物等近100科、300多種植物。近年，玉米黏蟲在我國華北、東北地區(qū)爆發(fā)成災(zāi)，嚴(yán)重危害著玉米生產(chǎn)。此外，鱗翅目的其它科相繼進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組或甚至基因組的測序，如小菜蛾、家蠶、帝王蝶，并獲得了較多的遺傳基因信息，而夜蛾科卻沒有進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，這為本研究提供了一個(gè)新的方向。玉米黏蟲基因組及表達(dá)譜序列信息非常有限，到目前為止只有線粒體基因組被測序，而NCBI中只有46個(gè)表達(dá)序

2、列信息。因此，本項(xiàng)研究中首先對(duì)玉米黏蟲進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，找到了12類與其RNAi機(jī)制相關(guān)的基因，為利用RNA干擾技術(shù)來控制玉米黏蟲奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組de novo序列組裝，玉米黏蟲的轉(zhuǎn)錄組序列Reads，被組裝為69，238條Unigenes。其中，45，227條Unigenes與已報(bào)導(dǎo)的基因有較高的同源性，得到了相應(yīng)功能的注釋信息，注釋率為65.32％。42，064（占45，227條Unigenes

3、的93.01％）條Unigenes被注釋到了NR數(shù)據(jù)庫;13，083（占45，227條Unigenes的28.93％）條Unigenes被注釋到了25個(gè)COG基因簇中;21，110（占45，227條Unigenes的46.68％）條Unigenes被注釋到了59個(gè)GO條目中;27，719（占45，227條Unigenes的61.29％））條Unigenes被注釋到了258個(gè)KEGG代謝通路中。⑵注釋到KEGG代謝通路中的Unigenes

4、，有998條與RNA運(yùn)輸途徑有關(guān)。從注釋到NR數(shù)據(jù)庫中的Unigenes中找到了98條序列與RNAi機(jī)制相關(guān)，這些序列分別被注釋到12類基因。從中選擇35條序列進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，27條可以獲得預(yù)期長度的DNA片段，它們包含于8類基因中，分別為Sid、Dicer、Argonaute、PIWI、Loquacious、SR-C、Juvenile hormone esterase和juvenilehormone epoxide hydrol

5、ase。RT-PCR驗(yàn)證成功率為77.14％，說明玉米黏蟲的轉(zhuǎn)錄組被有效的進(jìn)行了組裝。⑶通過RACE實(shí)驗(yàn)和引物組合PCR實(shí)驗(yàn)，成功的獲得了三個(gè)基因cDNA的部分序列:Sid(1511bp)、Dicer(2008bp)以及Argonaute(876bp)，并且獲得了Dicer基因的5'端序列。⑷通過Northern雜交實(shí)驗(yàn)，成功的檢測到了Sid、Dicer、Argonaute、PIWI基因的表達(dá)信號(hào)，且與預(yù)期大小較為一致。另外，從基因組上