對(duì)生葉序玉米轉(zhuǎn)錄組分析及候選基因篩選與克隆.pdf

1、對(duì)生葉序玉米是一種新的變異類型，在玉米中極為少見，它是研究植物葉序形成機(jī)理的極具價(jià)值的遺傳材料，同時(shí)也是一類珍貴的玉米種質(zhì)資源，具有重要的育種學(xué)意義。目前國(guó)內(nèi)外在對(duì)生葉序玉米研究主要集中在對(duì)生玉米形態(tài)特征和生理生態(tài)理論、對(duì)生葉序基因的標(biāo)記定位和激素調(diào)控基因指導(dǎo)下的形成機(jī)制等方面的研究，上述研究對(duì)玉米對(duì)生性狀的理論和規(guī)律進(jìn)行了初步探索和闡述，但是從分子機(jī)制上的研究較少。
　　本研究以近等基因系對(duì)生葉序玉米(H4D)與互生葉序玉米(H

2、4d)為材料，采用基于Ilumilla/Solexa測(cè)序的RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建了對(duì)互生玉米轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，篩選了對(duì)/互差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因的COG功能分類、GO顯著富集和Pathway顯著富集進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合前期對(duì)生基因的SSR分子標(biāo)記定位，利用轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)數(shù)據(jù)篩選獲得了玉米對(duì)生葉序候選基因并進(jìn)行了克隆和相關(guān)分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1、應(yīng)用Illumina/Solexa測(cè)序平臺(tái)發(fā)對(duì)對(duì)生和互生玉米進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)

3、序，分別獲得10，293，813和11，440，985個(gè)clean read，對(duì)、互生測(cè)序序列Q20=100％（測(cè)序錯(cuò)誤率＜1％），參照B73基因組分析模式，拼接組裝共獲得63540個(gè)基因。通過插入片段檢驗(yàn)、比對(duì)統(tǒng)計(jì)分析、cDNA片段隨機(jī)性實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)和基因覆蓋度統(tǒng)計(jì)等質(zhì)量評(píng)估表明Solexa測(cè)序質(zhì)量很好，能夠滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析信息需求。在此基礎(chǔ)上，對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了基礎(chǔ)分析，利用MISA分析軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)SSR分子標(biāo)記分析共獲得8個(gè)類型155

4、82個(gè)SSR分子標(biāo)記;對(duì)/互生玉米葉序剪接事件分析發(fā)現(xiàn)對(duì)/互生分別發(fā)生了6338和6970個(gè)剪接事件，其中內(nèi)含子保留剪接方式占據(jù)多數(shù)，約75％，而ALE、AFE和MEE在本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn);利用基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化在對(duì)/互生中分別預(yù)測(cè)了1181和947個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本，其中共有轉(zhuǎn)錄本940個(gè)，僅互生中發(fā)現(xiàn)的有7個(gè)，僅對(duì)生中發(fā)現(xiàn)有201個(gè)，對(duì)生葉序玉米中發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本更為豐富。
　　2、以Q_value≤0.01且| Log2(A/B)|≥1作為篩

5、選標(biāo)準(zhǔn)，在對(duì)/互生文庫(kù)差異比較中共獲得2432個(gè)差異基因(DEGs)，進(jìn)一步就DEGs表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)5倍以下和5倍以上的表達(dá)量差異各占約一半，說明了玉米對(duì)生葉序的突變發(fā)生導(dǎo)致了整個(gè)轉(zhuǎn)錄水平上眾多基因的表達(dá)量變化。在此基礎(chǔ)上，對(duì)DEGs進(jìn)行了COG功能分類、GO和Pathway顯著富集等分析。COG功能分類表明，DEGs中共有954個(gè)具有COG分類，分為25類，其中對(duì)生葉序玉米在轉(zhuǎn)錄功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及復(fù)制、重組和修復(fù)等方面上調(diào)基因約占

6、70％，可能在對(duì)生葉序發(fā)生過程中有更多的轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程發(fā)生;GO條目映射結(jié)果表明在所有的DEGs中，生物學(xué)過程、構(gòu)成細(xì)胞的組分和分子功能三個(gè)分類分別有906個(gè)、368個(gè)和1643個(gè)，進(jìn)一步應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，共獲得14個(gè)顯著富集的GO term，其中6條GO富集條目與植物生長(zhǎng)發(fā)育或者激素代謝相關(guān)。其中，最為顯著的脂肪氧化酶活性和氧化還原酶活性與植物生長(zhǎng)發(fā)育、赤霉素合成等直接相關(guān)，且在對(duì)生都為上調(diào);DEGs的Pathway顯著富集分

7、析表明了共有849個(gè)DEGs參與117條代謝途徑，以Q-value≤0.05為閥值，共有15條顯著富集，其中參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的Pathway中共有19個(gè)DEGs，3個(gè)編碼生長(zhǎng)素代謝途徑的SAUR家族基因在對(duì)生中全部下調(diào)，3個(gè)編碼參與細(xì)胞分裂素代謝的B-ARR和A-ARR反應(yīng)調(diào)節(jié)因子基因在對(duì)生玉米中全部上調(diào)，這與前期對(duì)生玉米內(nèi)源激素生理特性分析相一致。
　　3、結(jié)合玉米對(duì)生基因OPP-1和OPP-2的SSR分子標(biāo)記定位，利用轉(zhuǎn)錄

8、組數(shù)據(jù)，將19個(gè)玉米對(duì)生葉序差異基因進(jìn)行了染色體定位，利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析對(duì)染色體定位的差異基因進(jìn)行了詳細(xì)分析，其中11個(gè)對(duì)生葉序差異基因具有同源基因報(bào)道，但是蛋白都沒有明確功能，為預(yù)測(cè)或未知蛋白。重點(diǎn)篩選確定了SSR標(biāo)記定位之間的5個(gè)差異基因作為候選基因，啟動(dòng)子分析表明這些基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與激素（生長(zhǎng)素、赤霉素等）和光信號(hào)誘導(dǎo)相關(guān)的作用元件，可能在植物的激素信號(hào)識(shí)別及傳導(dǎo)過程中具有重要的作用。以對(duì)/互生cDNA為模

9、板進(jìn)行了這5個(gè)基因的克隆，其中GRMZM2G077744_ T01基因成功被克隆，經(jīng)測(cè)序和氨基酸序列比對(duì)，兩者相似性為97.30％。進(jìn)化樹分析該基因在單子葉植物中高度保守，屬于信號(hào)識(shí)別顆粒蛋白，蛋白特征分析表明兩者二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲具有差異，該差異是否會(huì)導(dǎo)致相關(guān)基因功能變化還有待于進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，本文利用RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建了對(duì)/互生玉米轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，篩選了差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因的GO和Pathway顯著富集進(jìn)