家蠶i-lem突變體的轉錄組分析與基因定位克隆.pdf

1、昆蟲復雜多樣化的色彩模式一直是生態(tài)學進化研究的興趣點所在，因為它們的出現與自然選擇息息相關。在鱗翅目昆蟲中，家蠶（Bombyx mori）是最適合識別鑒定負責顏色模式基因的模式生物，因為家蠶既存在許多體色突變體，又有基因組序列和高密度連鎖圖。家蠶體色突變體是研究昆蟲體色形成機制的寶貴生物資源。本文以家蠶黃體色抑制突變體i-lem為研究對象，利用轉錄組測序技術比較i-lem與黃體色突變體lem在轉錄水平上功能基因和生理代謝通路的差異，通過

2、定位克隆技術篩選 i-lem突變體的候選基因，以期對家蠶 i-lem突變發(fā)生的分子機制及其對色素合成調控相關的功能進行探究。主要結果如下：
　　一、轉錄組測序方面
　　1.成功構建了i-lem和lem兩個轉錄組測序文庫，Clean reads占Raw reads的比例為98.7％，Q30均高于96.2%，Total Mapped Reads占Clean reads在85.5%左右，其中Uniquely Mapped Read

3、s占Clean reads82.0%左右，Error rate和GC content都控制在合理的范圍之內，說明文庫的質量合格。
　　2.2個文庫間共發(fā)現86個差異表達基因，其中35個上調表達、51個下調表達。對差異表達基因進行GO分析和KEGG分析，分別富集到58個GO term和14條顯著性Pathway，所涉及基因的上下調表達可能影響蠶體內多個生理代謝途徑。
　　3. GO分析和KEGG代謝途徑中的差異表達基因主要分為

4、兩大類：表皮蛋白編碼基因和參與昆蟲先天性免疫應答系統(tǒng)的基因。28個表皮蛋白編碼基因和PAH、Serpin-4等9個昆蟲先天性免疫應答系統(tǒng)相關基因以及他們參與的代謝通路，是i-lem突變體與lem突變體之間的主要差異。
　　二、i-lem定位克隆方面
　　1.以ah09(+i-lem/+i-lem;lem/lem)和l82(i-lem/i-lem;lem/lem)作為親本，配制回交BC1M代群體，共收集358頭用于i-lem的

5、定位克隆研究。利用四眠期幼蟲體色差異鑒別出159頭i-lem突變型(淺黃)個體和199頭lem突變型(深黃)個體。利用11個可用分子標記在定位克隆群體中成功構建了i-lem連鎖圖譜，該圖譜包含72個交換個體，i-lem基因鎖定區(qū)域的物理距離約為170 kb，包含11個預測基因。
　　2.利用GO注釋、Smart網站、家蠶基因芯片數據信息以及RT-PCR分析結果表明，預測基因BMgn009799編碼的蛋白屬于醛酮還原酶（AKR）家族

6、，該基因在i-lem突變體與野生型之間擴增出不同長度的轉錄本。在+i-lem/+i-lem中轉錄出含7個外顯子的ORF，長度為1026 bp，編碼341 aa；而i-lem/i-lem中僅轉錄出長為270 bp的ORF，只包含第1和第7兩個外顯子，編碼89 aa的縮短型多肽，即BMgn009799在i-lem突變體缺失了外顯子2-6。
　　3.根據文獻報道，當墨蝶呤還原酶（SPR）發(fā)生功能障礙時，醛酮還原酶（AKR）或羰基還原酶（

7、CR）可以替代SPR參與四氫生物蝶呤（BH4）等蝶呤類色素的合成代謝途徑，而lem的突變表型（墨蝶呤大量沉積于體表）正是由于BmSPR的功能不足所致。因此，我們推測BMgn009799編碼的AKR家族成員很可能參與i-lem蠶體內的蝶呤類色素合成代謝途徑。
　　綜上，我們將定位區(qū)域內的預測基因BMgn009799鎖定為i-lem突變候選基因。i-lem突變蠶(i-lem/i-lem;lem/lem)通過編碼活性更高的AKR在BH4