家蠶白化突變(al)的定位克隆及其形成機(jī)制研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，同時(shí)也是鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲的重要模式生物。它具有適中的體型、較短的生命周期以及較高的繁殖率等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特點(diǎn)，同時(shí)具有基因組框架圖、精細(xì)圖、分子標(biāo)記連鎖圖譜、遺傳變異圖譜以及百余年經(jīng)典遺傳學(xué)所積累的完善的遺傳背景。家蠶具有豐富的突變體資源，其類型主要涉及體色、體形、軀體附肢發(fā)育、變態(tài)發(fā)育、卵色、卵形、氨基酸代謝、致死以及繭色、繭形等，是研究鱗翅目昆蟲的重要材料。
　　

2、昆蟲的體色與其覓食、求偶、體溫調(diào)節(jié)、躲避天敵、適應(yīng)環(huán)境等均有著密切關(guān)系，研究其體色形成模式具有重要的生物學(xué)意義。在家蠶的突變體資源中，體色相關(guān)突變體所占比例最大。研究家蠶體色突變體的形成機(jī)制不僅有助于了解鱗翅目昆蟲色素代謝相關(guān)基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還可能為家蠶重要的功能基因的利用提供新思路。本研究以家蠶典型的淡體色致死性突變白化（al）為研究對(duì)象，利用定位克隆技術(shù)成功分離鑒定了al突變的候選基因，并進(jìn)行候選基因功能驗(yàn)證及表型形成機(jī)制分析。取得

3、的研究結(jié)果如下:
　　1.白化突變(al)的分子定位及候選基因篩查
　　選用家蠶基因庫的al突變和野生型大造為親本，分別配制al突變的連鎖分析材料BC1F和定位分析材料BC1M。鑒于經(jīng)典遺傳研究已將al突變基因座位定位于第5連鎖群37.9cM，我們利用家蠶SSR連鎖圖譜第5連鎖群上的18對(duì)SSR標(biāo)記和新設(shè)計(jì)的60對(duì)染色體步移引物進(jìn)行多態(tài)性篩選、連鎖驗(yàn)證以及分子定位，最終將al突變的候選區(qū)域鎖定在nscaf2674上的標(biāo)記C2

4、4和D20之間400kb區(qū)域，且al位點(diǎn)與標(biāo)記C10緊密連鎖。
　　al突變的定位區(qū)間內(nèi)共有17個(gè)預(yù)測基因，對(duì)這些預(yù)測基因進(jìn)行信息分析表明，僅BGIBMGA003643基因的功能與黑色素代謝相關(guān)。已有研究表明，該基因編碼的PTPS酶主要參與四氫葉酸(BH4)的合成，而四氫葉酸又是黑色素代謝的關(guān)鍵酶基因（PAH和TH基因）所必須的輔酶，因此四氫葉酸以輔酶的形式參與黑色素的形成;一旦該基因出現(xiàn)問題將阻礙四氧葉酸的合成，從而黑色素代謝途

5、徑受阻，可能會(huì)出現(xiàn)缺乏黑色素的相應(yīng)表型，這與al突變的淡體色表型特征相吻合。且連鎖分析發(fā)現(xiàn)，該基因與al突變位點(diǎn)緊密連鎖。因此，我們將BGIBMGA003643基因作為al突變的候選基因，命名為BmPTPS基因。
　　2.al突變候選基因的克隆及表達(dá)模式分析
　　我們分別克隆了al突變和野生型大造中BmPTPS基因的全長cDNA和基因組序列，并詳細(xì)比較了該基因序列的差異。結(jié)果顯示:BmPTPS基因在大造和al突變中的基因組大

6、小分別為1893bp和1881bp;該基因上游序列在al突變中存在兩處缺失，大小分別為1192bp和314bp，且都是重復(fù)序列;BmPTPS基因在野生型大造和al突變中的cDNA全長分別為1014bp和1002bp。與大造相比，al突變?cè)诘诙怙@子上有11bp（另1bp的缺失在5'UTR內(nèi)）的缺失，而這11bp的缺失造成了移碼突變并形成了提前終止密碼子TAA，導(dǎo)致了BmPTPS基因不能正常翻譯成蛋白，功能上存在潛在的缺陷。
　　時(shí)

7、期和組織表達(dá)顯示，BmPTPS基因在大造幼蟲各個(gè)時(shí)期（從蟻蠶到五齡7天）和五齡3天各組織中都有表達(dá)。其中，BmPTPS基因在一齡食桑、二齡起、二齡眠、五齡1天以及五齡2天有高量表達(dá)，其余各時(shí)期的表達(dá)量較低;BmPTPS基因在頭、血液、馬氏管、神經(jīng)、生殖腺和整個(gè)絲腺中均有高量表達(dá)。整個(gè)時(shí)空表達(dá)模式分析表明，家蠶BmPTPS基因在一齡到二齡的各時(shí)期的表達(dá)量變化最為顯著，這與al突變出現(xiàn)表型的時(shí)期相吻合。同時(shí)，我們也通過qRT-PCR檢測了B

8、mPTPS基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在al突變中BmPTPS基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，僅為大造中的1/4。這些結(jié)果進(jìn)一步表明:BGIBMGA003643基因是al突變的候選基因。
　　3.al突變中四氫葉酸和黑色素代謝路徑關(guān)鍵基因的表達(dá)及物質(zhì)含量測定
　　為了驗(yàn)證BmPTPS基因的突變是否會(huì)影響四氫葉酸合成途徑中其他關(guān)鍵基因的表達(dá)，我們?cè)敿?xì)比較了大造和al突變中四氫葉酸合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)差異，定量結(jié)果顯示，在al突變

9、中，由于BmPTPS基因的突變，導(dǎo)致四氫葉酸合成通路中其他關(guān)鍵基因的表達(dá)都發(fā)生了相應(yīng)的變化，即位于該基因上游的GTPCH基因在al突變中明顯下調(diào)表達(dá)，而處于該基因下游的SPR和DHFR基因的表達(dá)量是顯著上調(diào)的。
　　由于四氫葉酸可作為苯丙氨酸羥化酶(PAH)和酪氨酸羥化酶(TH)的輔酶參與黑色素的合成，因此我們?cè)敿?xì)比較了野生型大造和al突變二齡起蠶中黑色素代謝相關(guān)基因的表達(dá)及兒茶酚胺類物質(zhì)多巴和多巴胺的含量差異。結(jié)果表明:在al突

10、變中PAH和TH的表達(dá)量顯著上調(diào)，同時(shí)這兩個(gè)酶催化的底物苯丙氨酸和酪氨酸含量也顯著高于大造中的含量，分別為大造中的36倍和4倍。而這兩個(gè)酶催化形成的產(chǎn)物多巴和多巴胺含量在al突變中卻是明顯下調(diào)的，僅為大造中的1/2和1/5。這些結(jié)果充分表明了al突變的形成原因:由于BmPTPS基因的突變，導(dǎo)致四氫葉酸合成不足，從而引起黑色素代謝受阻，導(dǎo)致黑色素的缺乏進(jìn)而產(chǎn)生了al突變的淡體色表型。
　　4.添食抑制劑DAHP后的表型及相關(guān)基因的表

11、達(dá)
　　從蟻蠶到二齡初期，我們持續(xù)向體色正常的家蠶品系N4添食GTPCH（鳥苷酸環(huán)化水解酶，BH4合成的限速酶）的抑制劑——2，4-二氨基-6-羥基嘧啶(DAHP)，對(duì)照組用0.1 mol/L NaOH處理。結(jié)果表明，添食抑制劑DAHP的實(shí)驗(yàn)組，一齡表型正常，第一次蛻皮后全部表現(xiàn)為與白化突變類似的表型，體色變淡，而對(duì)照組體色無明顯變化，表現(xiàn)為正常的黑色體色。同時(shí)我們也檢測了四氫葉酸和黑色素合成通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)抑制劑處

12、理后相關(guān)基因的表達(dá)均與白化突變的趨勢一致。熒光定量結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，GTPCH和PTPS基因的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組中顯著下調(diào)，而SPR和DHFR基因的顯著上調(diào)表達(dá)，黑色素代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵基因PAH和TH的表達(dá)都顯著上調(diào)。向出現(xiàn)類似白化表型的實(shí)驗(yàn)組重新飼喂BH4，結(jié)果表明，抑制劑處理后轉(zhuǎn)而飼喂BH4的蠶體色能夠回復(fù)為正常表型，而一直飼喂抑制劑DAHP的蠶則保持原來的類似al突變的淡體色不變。證實(shí)了抑制劑DAHP是通過抑制四氫葉酸的合成途徑

13、從而出現(xiàn)類似al突變表型的，同時(shí)也間接證明了al突變表型是由BmPTPS基因的突變引起的。
　　5.BH4回復(fù)實(shí)驗(yàn)
　　為了進(jìn)一步證實(shí)al突變是由BH4的缺乏引起的，我們?cè)O(shè)計(jì)了BH4的回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，添食BH4的al突變個(gè)體的體色回復(fù)為正常表型，而喂水對(duì)照組沒有明顯變化。BH4處理后的al突變個(gè)體中兩條通路關(guān)鍵基因的表達(dá)均介于野生型大造和al突變之間，逐漸趨于野生型大造。具體來說，與對(duì)照組喂水的al突變相比，在B