真姬菇育種中漆酶轉(zhuǎn)化體系的建立及機(jī)理分析.pdf

1、真姬菇又名玉蕈、斑玉蕈(Hypsizigus marmoreus)是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食用兼藥用的珍稀食用菌，也是目前工廠化生產(chǎn)的重要品種之一。但是，由于栽培周期長(zhǎng)(120-150d)、生物學(xué)效率低、易污染等問題，在一定程度上限制了其規(guī)模化發(fā)展。漆酶具有降解木質(zhì)素，氧化降解酚類物質(zhì)，抑制雜菌，改善出菇品質(zhì)等作用。本研究以漆酶活性較高的鳳尾菇和無漆酶活性的真姬菇作為實(shí)驗(yàn)材料，采用酶學(xué)與原生質(zhì)體融合相結(jié)合的技術(shù)，將鳳尾菇原生質(zhì)體經(jīng)高溫滅活與真姬

2、菇原生質(zhì)體融合，建立真姬菇育種中漆酶轉(zhuǎn)化體系。并通過RB-PDA平板顯色技術(shù)篩選出具有漆酶活性較高的兩融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A，并對(duì)其進(jìn)行了菌絲形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定、遺傳穩(wěn)定性分析、生物學(xué)特性及生產(chǎn)性能測(cè)定等研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.融合菌株的制備與篩選。
　　 原生質(zhì)體制備和融合條件優(yōu)化結(jié)果表明：2.0[％] 溶壁酶制備的原生質(zhì)體數(shù)量及質(zhì)量較高；在融合劑25[％]PEG(4000)、50mmol/L CaC

3、l2·H2O、甘露醇0.6mol/L、pH8.0，穩(wěn)滲劑0.6mol/L甘露醇的作用下，32℃水浴溫育25-30min融合效果較好。將融合后的原生質(zhì)體進(jìn)行再生培養(yǎng)，采用原生質(zhì)體滅活與RB-PDA平板顯色技術(shù)相結(jié)合，篩選出漆酶活性較高、生長(zhǎng)速度較快的兩融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A。
　　 2.融合菌株的鑒定。
　　 拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明，融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A與親本真姬菇、鳳尾菇的拮抗現(xiàn)象明顯，而且兩個(gè)融合菌株間也具有拮抗性。R

4、APD、ISSR引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，融合菌株Ⅲ18C，Ⅲ2A不僅具有與兩親本相同的條帶，而且出現(xiàn)了新的條帶；擴(kuò)增DNA譜帶的相似性指數(shù)分析顯示，兩融合菌株與親本真姬菇的相似指數(shù)較高，達(dá)到75[％]以上，說明融合菌株的基因組與真姬菇遺傳相似性較高。而且融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A與兩親本的相似指數(shù)均不同，說明兩融合菌株間的基因組具有差異性，屬不同的菌株。
　　 3.融合菌株遺傳穩(wěn)定性分析。
　　 融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A

5、傳代5次后，漆酶活性的檢測(cè)及漆酶基因的擴(kuò)增結(jié)果表明，兩融合菌株均能使RB-PDA平板變色，ABTS法測(cè)得其酶活分別為3.95U/mL、3.55U/mL，并擴(kuò)增出漆酶基因的一個(gè)片段。兩融合菌株出菇后組織分離獲得純培養(yǎng)菌種的漆酶活性測(cè)定及漆酶基因擴(kuò)增的結(jié)果與初次試驗(yàn)結(jié)果一致。說明兩融合菌株在傳代過程中漆酶基因能穩(wěn)定遺傳，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　 4.融合菌株生物學(xué)特性及生產(chǎn)性能測(cè)定。
　　 融合菌株Ⅲ18C，Ⅲ2A培養(yǎng)基

6、優(yōu)化、生物學(xué)特性及生產(chǎn)性能測(cè)定結(jié)果表明，融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A在PDA胡蘿卜培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快、活力較強(qiáng)；菌絲最適生長(zhǎng)溫度25℃，最適pH 6.5，最適含水量60[％]-65[％]；生產(chǎn)周期可縮短3-5d，生物學(xué)效率分別為72.86[％]、70[％]與親本真姬菇相比提高了17.15[％]、14.29[％]，而且菇型緊湊、整齊，短腿菇、大蓋菇較少，商品性狀明顯優(yōu)于真姬菇，表現(xiàn)出融合菌株Ⅲ18C，Ⅲ2A具有良好的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。融合菌株Ⅲ