柑橘原生質(zhì)體瞬時表達體系的建立及默科特橘橙轉(zhuǎn)GFP種質(zhì)的創(chuàng)造.pdf

1、柑橘是世界第一大水果，通過遺傳改良新技術(shù)創(chuàng)造優(yōu)良柑橘品種是提升我國柑橘市場競爭力的重要措施。珠心胚干擾、性器官敗育、童期長、遺傳上高度雜合等生物學特征嚴重阻礙了柑橘常規(guī)育種的進程。近年來，不斷完善的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為柑橘品種改良提供了一種更加快速有效的途徑。
　　 本研究以柑橘原生質(zhì)體為轉(zhuǎn)化受體，以綠色熒光蛋白基因（Green fluorescent protein gene，GFP）作為報告基因，建立了原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化體系，同時對影

2、響電擊轉(zhuǎn)化效率的幾個因素進行了探討和分析。另外，以默科特橘橙（Citrus reticulata× C．sinensis‘Murcott’）不同組織或器官為外植體進行農(nóng)桿菌介導的GFP轉(zhuǎn)化，獲得了一批穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因材料，為細胞融合、細胞凋亡以及遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)機制等研究提供了便利。主要結(jié)果如下：
　　 1．柑橘原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化瞬時表達體系的優(yōu)化。以廣東蜜橘（C．reticulata Blanco‘Guangdong tangeri

3、ne’）愈傷組織原生質(zhì)體作為電擊轉(zhuǎn)化受體轉(zhuǎn)化mgfp5-ER，分析了電擊緩沖液pH、電擊前原生質(zhì)體預處理等因素對瞬時表達效率的影響。結(jié)果表明：在直流脈沖強度為1250 V/cm，脈沖作用時間45μs，脈沖個數(shù)5個，脈沖間隔0.5 s，交變電場強度為50V/cm，作用時間40μs時，瞬時表達率最高，達到10.3％；電擊緩沖液pH為7時瞬時表達率最高；電擊前對原生質(zhì)體冰浴lO min，瞬時表達率無顯著提高。將該體系與PEG（聚乙二醇）介導的

4、遺傳轉(zhuǎn)化法進行比較，瞬時表達率差異不顯著。
　　 2．柑橘不同品種原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率差異較大。國慶一號（C．unshiu‘Guoqing No．1’）和廣東蜜橘愈傷組織原生質(zhì)體較易轉(zhuǎn)化，瞬時表達率分別為9.7％和10.9％；伏令夏橙（C．sinensis‘Valencia’）葉肉原生質(zhì)體較難轉(zhuǎn)化，偶見GFP瞬時表達；暗柳橙（C．sinensis Osbeck‘Anliu’）和默科特橘橙愈傷組織原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后未檢測到GFP瞬時表達。

5、
　　 3．默科特橘橙不同外植體轉(zhuǎn)化mgfp5-ER。以默科特橘橙胚性愈傷組織和試管實生苗的上胚軸切段、根軸聯(lián)結(jié)體、子葉為外植體，利用根癌農(nóng)桿菌介導法進行轉(zhuǎn)化，獲得了穩(wěn)定表達mgfp5-ER的轉(zhuǎn)基因胚性愈傷組織和轉(zhuǎn)基因芽；轉(zhuǎn)化效率因外植體而不同，其中以愈傷組織和上胚軸切段為外植體轉(zhuǎn)化效率較高，分別為13.3％和12.3％；種子成熟度影響轉(zhuǎn)化效率，以未成熟種子和成熟飽滿的種子獲得的試管實生苗進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率分別為8.0％和12.