草魚嗜水氣單胞菌感染免疫指標(biāo)變化及基因組DNA甲基化研究.pdf

1、草魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，由嗜水氣單胞菌引發(fā)的草魚運(yùn)動氣單胞菌敗血癥（又稱細(xì)菌性敗血癥）一直是制約草魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病。我們評價了池塘養(yǎng)殖草魚的健康水平，檢測了草魚各項(xiàng)免疫指標(biāo)，測定了感染草魚脾臟基因組DNA甲基化水平，旨在探究致病性嗜水氣單胞菌感染草魚的免疫機(jī)制，為草魚抗病育種提供理論依據(jù)。本研究的工作如下：
　　1.養(yǎng)殖草魚健康狀況評估
　　采用血液學(xué)、血清學(xué)分析方法，結(jié)合組織病理學(xué)技術(shù)對草魚進(jìn)行健康狀況評估。血

2、液學(xué)分析采用紅細(xì)胞計數(shù)（RBC）、白細(xì)胞計數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞比容（HCT）、平均紅細(xì)胞容積（MCV）和白細(xì)胞分類計數(shù)（DLC）（白細(xì)胞分類計數(shù)：單核細(xì)胞百分比、嗜中性粒細(xì)胞百分比、血栓細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比）；血清學(xué)分析主要包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性、溶菌酶（LYZ）活性、過氧化物酶（POD）活性、補(bǔ)體C3、C4定量和免疫球蛋白M（IgM）定量；組織學(xué)檢查包括取鰓、肝臟、體腎、腸道制作石蠟切片并結(jié)合HE

3、染色的方法，結(jié)果顯示：試驗(yàn)草魚白細(xì)胞計數(shù)值高于標(biāo)準(zhǔn)值的10倍，嗜中性粒細(xì)胞比例低于參考，血栓細(xì)胞比例偏高；血清ALT和AST值偏低，免疫球蛋白M定量高于參考值；組織病理學(xué)檢查鰓、肝臟organ index高，histological index為21-40（Class III-Class IV），而腎臟和腸道organ index低且病變程度未見超過Class II，表明實(shí)驗(yàn)草魚機(jī)體出現(xiàn)了可能由水質(zhì)變化或營養(yǎng)代謝異常而導(dǎo)致的鰓病變及肝功

4、能損傷，實(shí)驗(yàn)草魚均未發(fā)現(xiàn)病原菌感染。
　　2.感染嗜水氣單胞菌草魚免疫指標(biāo)測定
　　在確定草魚體質(zhì)健康的情況下，我們對草魚進(jìn)行嗜水氣單胞菌感染實(shí)驗(yàn)。之前通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定嗜水氣單胞菌半致死濃度為107cfu/ml。感染組草魚肌肉注射100μl經(jīng)二次活化后的嗜水氣單胞菌，對照組注射等量PBS溶液，分別經(jīng)0、1、3、7、14、21天取血液分析，每個時間點(diǎn)對照組、感染組各取3尾魚，分別測定血液中RBC、WBC、HCT、MCV和DLC和

5、血清中總蛋白（TP）、溶菌酶（LYZ）、過氧化物酶（POD）、免疫球蛋白M（IgM）和總補(bǔ)體（ACH50），每尾魚每個指標(biāo)測定3次。結(jié)果顯示：感染組白細(xì)胞計數(shù)顯著高于對照組，單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞百分比在感染后第1天顯著高于對照組；血栓細(xì)胞在感染后7-21天先上升后下降，與對照組相比差異極顯著；淋巴細(xì)胞在7-21天先下降后上升，與對照組相比差異顯著。血清學(xué)分析顯示，在感染1-3天，感染組總蛋白水平較對照組顯著上升；溶菌酶活性在1-7天表

6、現(xiàn)為先上升后下降，差異顯著；感染草魚過氧化物酶活力在第1天顯著下降；IgM和ACH50定量分別在感染7天、21天顯著上升。結(jié)果表明：草魚對嗜水氣單胞菌的感染分別在1-3、7-21天出現(xiàn)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，而免疫球蛋白M的上升表明此時后天免疫開始發(fā)揮作用，表明感染第3-7天為發(fā)病高峰期。
　　3.感染嗜水氣單胞菌草魚基因組DNA甲基化研究
　　我們用半致死濃度嗜水氣單胞菌感染草魚，分別在0、12h、24h、48h、72h取脾臟，提

7、取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，用于基因組DNA甲基化水平（5-mc％）檢測。發(fā)現(xiàn)72h基因組DNA甲基化水平顯著高于0h，將0h和72h脾臟基因組DNA進(jìn)行高通量測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0h和72h同一覆蓋度的同種位點(diǎn)差異不大，CG位點(diǎn)隨著覆蓋度的增加甲基化比例也逐漸升高，CHG和CHH比例逐漸降低。本次測序4個脾臟DNA樣品兩兩比較，在genebody統(tǒng)計到974和1010個差異表達(dá)基因，在TSS附近統(tǒng)計到1812和2011個差