IVF出生小鼠及其后代基因組DNA甲基化修飾變化研究.pdf

1、本文對IVF出生小鼠及其后代基因組DNA甲基化修飾變化進行了研究。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：IVF出生小鼠及其之間交配出生后代行為學、形態(tài)學及全基因組甲基化模式的研究。
　　 目的：通過IVF小鼠模型的建立，完成以IVF為代表的ART出生群體之間婚育安全性動物模型方面的評估，揭示ART的對人類未來可能的表觀遺傳學效應。
　　 方法：①建立IVF小鼠模型，獲得IVF出生F1代小鼠；6-7周齡時，IVF

2、F1代小鼠雌雄性合籠，自然交配受孕，獲其F2子代；②以自然出生小鼠為對照，分別于6-7周齡時，進行F1代，F(xiàn)2代小鼠的水迷宮實驗，評價其學習及記憶能力；③以自然出生小鼠為對照，開展F1代，F(xiàn)2代小鼠的體重、器官測量，外表結構畸形觀察、組織器官的大體和組織形態(tài)學檢測和分析；④應用小鼠全基因組甲基化芯片，對F1代及F2代小鼠及自然妊娠出生小鼠各四只進行全基因組水平的甲基化的檢測，比較三組全基因組水平的甲基化的模式；⑤選取8個在F1、F2代同

3、時發(fā)生高甲基化的啟動子位點：Crygα、Fgf1、Nos3、Mb、Myog、Notch3、Th和Vαv1以及4個只有在F2代發(fā)生高甲基化的啟動子位點：Col9α2、Fgf6、Lck和Slc5α1進行亞硫酸氫鹽測序，對芯片的部分結果進行驗證；⑥采用熒光定量PCR方法檢測經(jīng)亞硫酸氫鹽測序證實在F1代陽性的位點：Fgf1、Nos3、Notch3、Th和Vαv1以及在F2代的陽性位點：Col9α2、Fgf1、Fgf6、Nos3、Notch3、S

4、lc5α1、Th及Vαv1的表達，明確甲基化狀態(tài)其對其mRNA表達情況的影響。
　　 結果：⑴成功建立IVF F1代小鼠模型及F2代模型；⑵水迷宮實驗顯示IVF F1、F2代組與自然妊娠出生小鼠相比在潛伏期、游泳距離等方面無顯著性差異；⑶IVF F1、F2代的體重、器官比重及組織形態(tài)學與自然妊娠出生小鼠相比無顯著性差異；⑷小鼠腦組織全基因組甲基化芯片結果顯示，在F1代中共有225個CpG島及191啟動子區(qū)域發(fā)生了高甲基化；22個

5、CpG島和28啟動子區(qū)域發(fā)生了低甲基化。F2代有196個CpG島和213個啟動子區(qū)域高甲基化；69個CpG島，56個啟動子發(fā)生了低甲基化。F1代與F2代相比，共有113個啟動子和143個CpG島發(fā)生了共同的高甲基化；⑸在經(jīng)亞硫酸氫鹽測序驗證的8個啟動子中，F(xiàn)gf1、Nos3、Notch3、Th及Vαv1在F1、F2代甲基化的程度較自然妊娠組高，差異有顯著性，符合芯片發(fā)現(xiàn)的結果。4個只在F2代發(fā)生高甲基化的位點中，有3個發(fā)生了高甲基化，符

6、合芯片的發(fā)現(xiàn)；⑹熒光定量PCR方法顯示Fgf1、Nos3、Notch3、Lck、Co19a2、Fgf6及Slc5α1的表達受到其甲基化狀態(tài)得影響，其mRNA的表達有不同程度的降低，但Th、Vαv1沒有顯示這種趨勢。
　　 結論：①IVF對F1、F2代小鼠的學習和記憶能力、生長發(fā)育及器官形態(tài)等沒有明顯的影響；②IVF出生小鼠腦組織基因組DNA甲基化修飾存在改變，尤以高甲基化異常明顯，并可影響到基因的表達；③IVF出生小鼠的部分基因

7、組DNA甲基化修飾異?？梢詡鬟f給其相互交配出生的后代，同時這些后代也有新的DNA甲基化修飾異常發(fā)生，此類異常甲基化同樣可影響基因的表達。
　　 第二部分：IVF所致異常甲基化向后代傳遞的遺傳方式研究。
　　 目的：分析IVF出生小鼠基因組DNA異常甲基化的子代傳遞方式，為探索異常甲基化發(fā)生機制和可能阻斷途徑提供研究基礎。
　　 方法：①將IVF出生的雌性及雄性F1代小鼠分別與野生型雄性及雌性小鼠交配獲得母源和父源

8、IVF F2代小鼠；②選取3個前期研究中發(fā)現(xiàn)在F1、F2代同時發(fā)生高甲基化位點：Fgf1、Nos3、Notch3以及3個只有在F2代發(fā)生高甲基化位點：Col9α2、Fgf6、Slc5α1，分別在母源和父源IVF F2代小鼠考察上述啟動子區(qū)域的甲基化模式；③熒光定量PCR方法檢測Fgf1、Nos3、Notch3、Col9α2、Fgf6及Slc5α1在母源和父源IVF F2代小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達，明確甲基化狀態(tài)其對其mRNA表達的影響。

9、
　　 結果：⑴2個在IVF F1和F2代同時發(fā)生高甲基化的位點：Fgf1、Notch3以及3個只有在IVF F2代發(fā)生高甲基化位點：Col9α2、Fgf6和Slc5α1，在母源IVF F2代小鼠腦組織中，其甲基化程度與自然妊娠出生小鼠無顯著差異。但Nos3仍表現(xiàn)出高甲基化，且熒光定量PCR結果顯示Nos3基因的表達也存在不同程度的降低；⑵3個在IVF F1和F2代同時發(fā)生高甲基化的位點：Fgf1、Nos3、Notch3以及3個

10、只有在F2代發(fā)生高甲基化位點：Col9α2、Fgf6及Slc5α1，在父源IVF F2代小鼠的腦組織中，其甲基化程度與自然妊娠出生小鼠均無顯著差異。
　　 結論：①IVF F1代雄性小鼠發(fā)生的基因組DNA甲基化修飾異常，在其后代可得以糾正；②IVF F1代雌性小鼠發(fā)生的甲基化修飾異常，存在傳遞給其后代的風險；③IVF出生小鼠相互交配出生的F2代小鼠的異常甲基化可能主要是通過母源傳遞。
　　 第三部分：Nos3啟動子在母源

11、F3代的甲基化狀態(tài)及IVF出生雙胎子代臍血印跡基因調(diào)控區(qū)KvDMR1、H19/IGF2 DMR及PEG1甲基化狀況。
　　 目的：進一步考察在母源IVF F2代小鼠中發(fā)生異常的Nos3位點是否可以進一步傳遞；研究IVF雙胎子代臍血中幾個重要印記基因調(diào)控區(qū)的甲基化狀況，分析IVF雙胎子代中印跡狀態(tài)異常風險。
　　 方法：①將論文第二部分的母源IVF F2代進一步與野生型的C57/BL6J雄性小鼠之間交配，獲的母源IVF F

12、3代，以自然妊娠子代為對照；同時熒光定量RT-PCR進一步檢測Nos3所調(diào)控基因的mRNA表達水平；②共收集59對雙胎臍血標本，其中29對IVF雙胎組成研究組，30對自然妊娠雙胎組成對照組，采用亞硫酸氫鹽測序對兩個母源性甲基化印記區(qū)域(KVDMR1、PEG1)及一個父源性甲基化印記區(qū)域(H19/IGF2 DMR)進行甲基化模式檢測和比較。
　　 結果：⑴在母源IVF F2代小鼠中異常甲基化的Nos3位點在母源IVF F3代與自然

13、妊娠出生的小鼠相比已無差別，Nos3基因表達水平到母源F3代已經(jīng)無顯著性變化；⑵IVF和自然妊娠雙胎子代均未發(fā)現(xiàn)有PEG1基因的印記缺失，二組甲基化程度無顯著性差異(P=0.103)。3例IVF雙胎子代中存在KvDMR1低甲基化，甲基化程度在21％左右，發(fā)生率為5.08％(3/58)，1例自然妊娠雙胎子代存在低甲基化，發(fā)生率為1.67％(1/60)，二者相比，無統(tǒng)計學差異(P=0.611)。IVF和自然妊娠雙胎子代各有1例存在H19/I